熱原檢查法

1、※熱原檢查法藥檢文摘日期:2004811熱原檢查法1緒言熱原也稱為發(fā)熱性物質(zhì)（日本藥局方）英文叫做Pyrogen，即能夠引起恒溫動物體溫異常升高的物質(zhì)總稱。與注射劑有關的發(fā)熱性物質(zhì)研究可追溯到16世紀。直到18世紀丹麥生理學家panum的研究中斷定，“發(fā)熱物質(zhì)是一種對熱穩(wěn)定，溶于水，不溶于乙醇，由活的細菌中來的一類物質(zhì)，而且微量靜注后就能引起高熱反應”。1923年，Seibert肯定地證實了所有注射劑的發(fā)熱原因是通過革蘭氏陰性菌所產(chǎn)生的

2、一種可濾過的高熱穩(wěn)定的熱原污染結(jié)果。隨后Rademaker進一步證實了Seibert的發(fā)現(xiàn)，并進一步強調(diào)避免細菌污染的重要性。之后的共同研究確立了使用家兔檢測注射劑及水中致熱物質(zhì)的方法。這個結(jié)果導致了官方的重視，20年后，美國藥典于1942年USP12）進行了收載其后，各國藥典相繼收載，CHP→1953年BP→1953年JP→1951年第6版藥局方半個多世紀來，熱原檢查法在保證注射劑的安全用藥方面發(fā)揮了重要作用。2熱原與熱原反應熱原即發(fā)

3、熱性物質(zhì)，目前普遍認為是由革蘭氏陰性菌所產(chǎn)生的內(nèi)毒素（脂多糖），廣義說，是所有引起恒溫動物體溫異常升高物質(zhì)的總稱。除內(nèi)毒素引起發(fā)熱外，還包括病毒，干擾素以及其它種種發(fā)熱物質(zhì)。熱原反應是指臨床輸液反應，如果將攜帶超量熱原物質(zhì)的注射液靜脈輸入人體，通常在052h內(nèi)引起機體嚴重的臨床反應。表現(xiàn)為：機體外周皮膚血管收縮，停止排汗，散熱減少，發(fā)生冷感、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐，嚴重時可出現(xiàn)昏迷、休克、死亡等一系列臨床癥狀，體溫通?？缮仙?0

4、℃左右。3熱原的本質(zhì)在自然界，熱原分布很廣，可以說無處不在，無處不有，關于熱原本質(zhì)的研究，目前在世界范圍內(nèi)，主要存在二種觀點。一種觀點是：熱原的本質(zhì)就是革蘭氏陰性菌所產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素，就注射劑來講，其輸液反應主要來源于細菌內(nèi)毒素。另一種觀點是：熱原可能是一類能刺激哺乳動物巨噬細胞MQ所產(chǎn)生的細胞分裂素Cytokines的物質(zhì)的總稱。所謂細胞分裂素是一類內(nèi)源性物質(zhì)（包括：白細胞介素1，白細胞介素6TNF等）和干擾素類。這些內(nèi)源性的熱原質(zhì)可

5、直接作用于大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)刺激體溫中樞，最后使機體發(fā)熱。4、內(nèi)毒素分子結(jié)構（略）5、細菌毒素（內(nèi)毒素與外毒素）性質(zhì)與特點一般細菌毒素分為兩類，一類為外毒素Exotoxin）是一種毒性蛋白質(zhì)，是細菌生長過程中分泌到菌體外的毒性物質(zhì)，產(chǎn)生外毒素的細菌主要是G—白喉桿菌、破傷風桿菌、肉毒桿菌、金黃色葡萄球菌以及少數(shù)革蘭氏陰性菌，另一類為內(nèi)毒素endotoxin），是革蘭氏陰性菌細胞外壁層上的特有結(jié)構，細菌在生活狀態(tài)時不釋放出來，只有當細菌死亡

6、自溶或粘附在其他細胞時，才表現(xiàn)出毒性，內(nèi)毒素的主要化學成分是脂多糖中類脂A成分。其他方法－免疫測定方法ELISA法等常用的化學方法BET，是最近20年來發(fā)展最快的方法、BET法的優(yōu)點是方便、快捷、靈敏、經(jīng)濟、克服了生物測定的誤差。USP2000年24版，600多種，中國藥典2000版69種，還在做工作，5年后估計200種左右。10、中國藥典熱原檢查法：中國藥典98增補本、2000年版較1995年版以前，熱原檢查法有較大的修訂。2000年

7、版藥典附錄IXD熱原檢查法本法系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。供試用的家兔應健康無傷，體重1730kg，雌兔應無孕。預測體溫前7日即應用同一飲料飼養(yǎng)，在此期間內(nèi)，體重應不減輕，精神、食欲、排泄等有得有異?，F(xiàn)象。未經(jīng)使用于熱原檢查的家兔；或供試品判定為符合規(guī)定，但組內(nèi)升溫達06℃家兔；或三周內(nèi)未曾使用的家兔，均應在檢查供試品前37天內(nèi)預測體溫，進行挑選

8、。挑選試驗的條件與檢查供試品時相同，僅不注射藥液，每隔30分鐘測量體溫1次，共測8次，8體溫均在380396℃的范圍內(nèi)，且最高最低體溫的差數(shù)不超過04℃的家兔，方可供熱原檢查用。用于熱原檢查后的家兔，如供試品判定為符合規(guī)定，至少應休息2日方可供第2次檢查用。如供試品判定為不符合規(guī)定，則組內(nèi)全部家兔不再使用。每一家兔的使用次數(shù)，用于一般藥品的檢查，不應超過10次。試驗前的準備在作熱原檢查前1－2日，供試用家兔應盡可能處于同一溫度的環(huán)境中，

9、實驗室和飼養(yǎng)室的溫度相差不得大于5℃，實驗室的溫度應在17－28℃，在試驗全部過程中，應注意室溫變化不得大于3℃，應避免噪音干擾。家兔在試驗前至少1小時開始停止給食并置于適宜的裝置中，直至試驗完畢。家兔體溫應使用精密度為01℃的肛溫計，或其他同樣精確的測溫裝置。肛溫計插入肛門的深度和時間各家兔應相同，深度一般約6cm，時間不得少于1分半鐘，每隔30分鐘測量體溫1次，一般測量2次，兩次體溫之差不得超過02℃，以此兩次體溫的平均值作為該兔的

10、正常體溫。當日使用家兔，正常體溫應在380－396℃的范圍內(nèi)，且各兔正常體溫之差不得超過1℃。試驗用的注射器、針頭及一切和供試品溶液接觸的器皿，應置烘箱中用250℃加熱30分鐘或用180℃加熱2小時，也可用其他適宜的方法除去熱原。檢查法取適用的家兔3只，測定其正常體溫后15分鐘以內(nèi)，自耳靜脈緩緩注入規(guī)定劑量并溫熱至約38℃的供試品溶液，然后每隔30分鐘按前法測量其體溫1次，共測6次，以6次體溫中最高的一次減去正常體溫，即為該兔體溫的升高

11、度數(shù)。如3只家兔中有1只體溫升高06或06℃以上，或3只家兔體溫升高均低于06℃，但升高的總數(shù)達14℃或14℃以上，應另取5只家兔復試，檢查方法同上。結(jié)果判斷在初試3只家兔中，體溫升高均低于06℃，并且3只家兔體溫升高總數(shù)低于14℃；或在復試的5只家兔中，體溫升高06℃或06℃以上的兔數(shù)僅有1只，并且初試、復試合并8只家兔的體溫升高總數(shù)為35℃或35℃以下，均認為供試品的熱原檢查符合規(guī)定。在初試3只家兔中，體溫升高06℃或06℃以上的兔