無菌檢查法

1、2010版藥典無菌檢查法主要增修訂及其展望,,,,,國內(nèi)外藥典微生物學(xué)檢驗 發(fā)展的宗旨： —— 提高方法撿出率、保證檢驗結(jié)果的準確性、可靠性。 1、 實驗環(huán)境、設(shè)施的發(fā)展； 2、 培養(yǎng)基的品種和適用性要求； 3、 檢驗數(shù)量、檢驗量符合統(tǒng)計學(xué)要求； 4、 檢驗方法和儀器的改進 （薄膜過濾法、全封閉過濾培養(yǎng)器） 5、 驗證試驗；（ICH、USP、EP、BP、JP均有規(guī)定） 6、 培養(yǎng)時間； 7、

2、 結(jié)果 的分析和判斷； 等。,回顧國際無菌檢查法發(fā)展歷史 1925年 直接接種法首先使用在英國1932年 英國藥典推薦使用無菌測試1936年 美國藥典第十一章首先引用單個培養(yǎng)基的直接接種法1950年 美國藥典第十六章推薦使用FTG和SB兩種培養(yǎng)基分別 培養(yǎng)需、厭氣 菌和真菌1957年 美國FDA和MILLIPORE公司介紹膜過濾法用于抗生素?zé)o菌測試1963年 英國藥典6

3、3版收載薄膜過濾法無菌測試1965年 美國藥典引用薄膜過濾法用于非抑菌性藥品的無菌測試1971年 歐洲藥典第二版公布參照薄膜過濾法無菌測試1978年 歐洲藥典修訂版發(fā)行公布推薦使用薄膜過濾法無菌測試1988年 美國FDA規(guī)定：假如第一次無菌檢查不符合規(guī)定的樣品不再復(fù)試，這 一批次的藥品應(yīng)報廢。實際上排除了藥品無菌陽性后再測試的機會1998年 英國藥典1998無菌測試以一次檢出為準

4、，取消復(fù)試。2000年 美國藥典24版無菌測試以一次檢出為準，取消復(fù)試。,檢視我國歷版藥典無菌檢查法發(fā)展歷史 1953版 實驗環(huán)境僅要求為半無菌操作箱；僅收載一種直接接種法； 用一種培養(yǎng)基檢查1963版 僅一種直接接種法；用三種培養(yǎng)基分別培養(yǎng)細菌和霉菌1977版 開始收載薄膜過濾法（簡單裝置），用二種培養(yǎng)基分別

5、培 養(yǎng)細菌和霉菌1985版 收載薄膜過濾法限于抗生素樣品；用需、厭氣菌培養(yǎng)基及 霉菌培養(yǎng)基；要求實驗環(huán)境為紫外線滅菌的無菌室。1990版 與85年版相同1995版 開始要求對培養(yǎng)基進行靈敏度檢查。2000版 規(guī)定實驗環(huán)境為100級潔凈度；檢驗數(shù)量從2支/瓶增加為

6、6～11支/瓶；明確薄膜過濾法為首選方法包括大容量液體樣品 首次引用、收載全封閉過濾技術(shù)。,對比國際無菌檢查發(fā)展歷史 ， 我國2000版以前藥典無菌檢查法因技術(shù)和認識的不足，對提高方法撿出率、保證檢驗結(jié)果的準確性、可靠性方面的規(guī)定與先進國家藥典中的要求嚴重脫節(jié)。,2005版無菌檢查法取得長足發(fā)展 實驗環(huán)境要求 、驗證試驗、 延長培養(yǎng)時間至少為14天、以一次檢出為準，取消復(fù)試等亮點。

7、是2005年版藥典無菌檢查法的大步發(fā)展，從而使2005年版無菌檢查法比歷版無菌檢查法有了突破性的提高。 基本與國際先進藥典無菌檢查法接軌。,2010年版藥典無菌檢查法的發(fā)展，主要是在總結(jié)和鞏固實施驗證試驗以來所取得經(jīng)驗及認識的基礎(chǔ)上，作兩方面的發(fā)展： 一、附錄無菌檢查法（一部附錄ⅩⅢ B） （二部附錄Ⅺ H）

8、 （三部附錄Ⅻ A） 圍繞著保證實驗結(jié)果的準確性、可靠性作進一步的增、修訂。 二、品種各論中【無菌】各論化的發(fā)展,一、附錄無菌檢查法中的增、修訂 （一）總則部分 （二）培養(yǎng)基部分 （三）靈敏度檢查部分 （四）稀釋液、沖洗液部分 （五）方法驗證部分 （六）薄膜過濾法部分 （七）培養(yǎng)及觀察部分 （八） 結(jié)果判斷部分 （九） 表1、表2和表3,,（一）總則部分 新增規(guī)

9、定1、“ 防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出?！?、“ 日常檢驗還需要對環(huán)境進行監(jiān)控。”3、“ 無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識，并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓(xùn)。,,（二）培養(yǎng)基部分1、刪除： 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 后括號（用于培養(yǎng)好氧菌、厭氧菌）的說明2、刪除： 改良馬丁培養(yǎng)基 后括號（用于培養(yǎng)真菌）的說明,,3、刪除： 選擇性培養(yǎng)基 項下加入適量中和劑或表面活性劑 “ 如對氨基苯甲酸（用于磺胺類供試品）、聚山梨

10、酯80（用于非水溶性供試品）或β-內(nèi)酰胺酶（用于β-內(nèi)酰胺類供試品）”等說明。 修訂為： 在培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同驗證試驗。 增訂：表1 常見干擾物的中和劑或滅活方法 (見微生物限度檢查法中）,,,表1 常見干擾物的中和劑或滅活方法,,4、將原排列第 6. 的 0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（用于硫酸鏈霉素等抗生素的無菌檢查）

11、修訂排列為第 4. ——按順序歸類培養(yǎng)基1.～4. 均為直接用于無菌檢查的液體培養(yǎng)基。,（三）培養(yǎng)基靈敏度檢查部分1、在菌液制備中，修訂黑曲霉的孢子懸液制備方法：規(guī)定應(yīng)使用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液，洗脫孢子及稀釋孢子液，制成每1ml中含孢子數(shù)小于100 cfu的孢子懸液。 刪除了：（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細吸管） 吸出孢子懸液的操作方法,,2、新增加稀釋后的工作用菌液

12、的保存條件和保存期限： 菌液制備后“若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用，若保存在2～8℃，可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2℃～8℃，在驗證過的貯存期內(nèi)使用?！?（四） 稀釋液、沖洗液及其制備方法部分 在原有 1. 0.1%蛋白胨水溶液 2. pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖新增加：可根據(jù)供試品的特性，選用其他經(jīng)驗證過的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。,（五）方法驗證試驗部分1

13、、驗證試驗用菌種及菌液制備在培養(yǎng)基靈敏度所用菌種的基礎(chǔ)上，刪除銅綠假單胞菌，增訂大腸埃希菌。 ——是因在驗證試驗的實踐中，發(fā)現(xiàn)作為革蘭氏陰性桿菌代表的銅綠假單胞菌在驗證試驗中對大部分抗生素不敏感，而大腸埃希菌對抗革蘭氏陰性桿菌為主的抗生素敏感性較好。,2、驗證試驗中樣品用量的規(guī)定：刪除了原：“ 將規(guī)定量供試品按… ”修訂為 薄膜過濾法： “ 取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按

14、 薄膜過濾法過濾” 直接接種法： “接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量” —— 明確了驗證試驗所需樣品量是供試品的檢驗量而不是供試品的檢驗數(shù)量。,（六）供試品的無菌檢查部分1、陽性對照用量的修訂： 原：“若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品1支（或瓶）作陽性對照用?！毙抻啚?：若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品無菌檢查時每個培養(yǎng)基容器接種的樣品量作陽性對照用。——因若是液體制劑，應(yīng)該采用薄膜過濾法，若

15、是固體制劑每管接種量可能不止1支（或瓶），應(yīng)按驗證的方法確定。,2、薄膜過濾法中的增、修訂：2.1 新增規(guī)定：抗生素供試品應(yīng)選擇低吸附的濾器及濾膜2.2 新增規(guī)定：對每片濾膜的總沖洗量不得過1000ml2.3 新增規(guī)定：所用沖洗量、沖洗方法同驗證試驗,2.4 修訂：無菌氣（噴）霧劑供試品的檢驗方法： 規(guī)定置至少-20℃冰室冷凍1小時。并新增開啟容器后 “將供試品轉(zhuǎn)移至無菌容器中”的操作步驟。,2.5 修

16、訂：裝有藥物的注射器供試品的檢驗方法：刪除 原 “裝上無菌針頭（非包裝中所配帶的）” 修訂為 “取規(guī)定量，排出注射器中的內(nèi)容物，若需要可吸入稀釋液或標簽所示的溶劑溶解，直接過濾，” ——沒有必要將原裝配好的針頭取下來,3、 直接接種法中的增、修訂：刪除了原直接接種法中ß-內(nèi)酰胺類或黃胺類供試品項 。——因該兩類供試品的無菌檢查以采用薄膜過濾法加中和劑更好。,4、 培養(yǎng)及觀察中的增、修訂： 對于培

17、養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長時，刪除了：“或劃線接種于斜面培養(yǎng)基上” 的規(guī)定。必然刪除：可根據(jù)斜面是否有菌生長而判斷的規(guī)定。,（七）結(jié)果判斷部分新增訂：陽性對照管應(yīng)生長良好，陰性對照管不得有菌生長。否則，試驗無效?！獜娬{(diào)陽性對照、陰性對照在無菌檢查實驗成立與否中的作用。,（八） 表1、表2和表3部分 表1將表1第3列的表題原 “每種培養(yǎng)基最少檢驗數(shù)量” 修訂為：“接種每種培養(yǎng)基所需的最少檢驗數(shù)

18、量” ——更明確指出接種到培養(yǎng)基中去的檢驗量。修訂了表1下的 注: 對供試品容器裝量不夠接種兩種培養(yǎng)基的情況，明確規(guī)定最少檢驗數(shù)量應(yīng)加倍。,表2將表2原名稱：“上市抽驗樣品（液體制劑）的最少檢驗數(shù)量” 修訂為：“ 液體制劑最少檢驗量及上市抽驗樣品的最少檢驗數(shù)量”——明確液體制劑最少檢驗量見表2的第2列，供試品最少檢驗數(shù)量見表2的第3列。 · 修訂了表2下的 注: ——對供試品容器裝量不夠接

19、種兩種培養(yǎng)基的情況，明確規(guī)定最少檢驗數(shù)量應(yīng)加倍。,表3 ·將表3原名稱：“上市抽驗樣品（固體制劑）的最少檢驗量” 修訂為：“ 固體制劑最少檢驗量及上市抽驗樣品的最少檢驗數(shù)量” ——明確固體制劑最少檢驗量見表3第2列；供試品最少檢驗數(shù)量見表3的第3列。·修訂了表3下的 注: ——對供試品容器裝量不夠接種兩種培養(yǎng)基的情況，明確規(guī)定最少檢驗數(shù)量應(yīng)加倍。,二、各論中【無菌】各論化的發(fā)展 舉

20、例如下：乙酰谷酰胺注射液、丁溴東莨菪堿注射液 無菌：取本品，經(jīng)薄膜過濾法處理，用0.1％無菌蛋白胨水溶液分次沖洗（每膜不少于100ml），以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌，依法檢查（附錄ⅪH），應(yīng)符合規(guī)定。,舉例如下：頭孢曲松鈉、頭孢拉定、頭孢哌酮鈉、頭孢硫脒、注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀、鹽酸林可霉素注射液 無菌：取本品，用適宜溶劑溶解后轉(zhuǎn)移至不少于500ml的0.9%無菌氯化鈉溶液中，用薄膜過濾法處理后，依法檢查（附錄Ⅺ

21、H），應(yīng)符合規(guī)定。氧氟沙星氯化鈉注射液 無菌：取本品，經(jīng)薄膜過濾法處理，用0.1％無菌蛋白胨水溶液分次沖洗（每膜不少于500ml）每管培養(yǎng)基中加入0.1mol/L硫酸錳溶液1ml,以大腸埃希菌為陽性對照菌，依法檢查（附錄ⅪH），應(yīng)符合規(guī)定。,一、無菌檢查用培養(yǎng)基的不斷改進二、增加對檢出菌的檢定要求三、對每種接種后的培養(yǎng)基分別置兩種溫度（適合細菌生長和適合真菌生長）下培養(yǎng)四、各論化中無菌檢查表述的進一步規(guī)范化,無菌檢查法的展

22、望,一、無菌檢查用培養(yǎng)基的不斷改進,1、應(yīng)與國際先進藥典無菌檢查法所用培養(yǎng)基保持一致 理由（1）與USP/BP/EP/JP保持一致便于國際交流。,理由（2） USP中大豆酪蛋白胨培養(yǎng)基靈敏度測定要求用3種菌：枯草桿菌、白念、黑曲檢查。我國藥典改良馬丁培養(yǎng)基靈敏度測定只要求2種菌：白念、黑曲。 實驗證明大豆酪蛋白胨培養(yǎng)基同時適合真菌、細菌的生長，有利于提高污染菌的檢出率。,2、須進一步深入開展

23、無菌檢查用培養(yǎng)基的研究與開發(fā)理由（1） 無菌檢查用培養(yǎng)基曾從僅1種發(fā)展起來，且配方也逐步調(diào)整。隨著對藥品安全的保證和藥品無菌檢查要求的不斷提高，無菌檢查用培養(yǎng)基應(yīng)不斷改進。理由（2） 任何一種培養(yǎng)基不可能把藥品中可能存在的菌都培養(yǎng)出來。,理由（3） 與培養(yǎng)基靈敏度試驗用菌相比較，藥品中的污染微生物會更廣泛、活性更低。 理由（4） 如存在某些苛養(yǎng)菌、亞致死狀態(tài)菌——是否需要添加更

24、豐富的營養(yǎng)成分，如動物的血液、動物組織提取液等才能被檢出。,理由（5） 據(jù)報道：巰乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中指示劑刃天青對微生物有一定抑制作用，（加0.1%刃天青1ml~0.5ml對靈敏度無顯著差異。） 美國藥典中同時收載兩種巰乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基供選擇，其中之一無刃天青和瓊脂——引入思考：什么情況下應(yīng)選擇用？為什么我國只收載一種？,理由（5） 可能存在嚴格厭氧菌——巰乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中所營造的厭氧環(huán)境是否足

25、以滿足嚴格厭氧菌的培養(yǎng)需要？ ——引入思考：現(xiàn)無菌檢查的實驗操作、培養(yǎng)條件是否足夠能滿足嚴格厭氧菌的檢出。,二、增加對檢出菌的檢定要求,理由（1） 面臨更高的要求。 隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展和國際交往的頻繁，人們對物質(zhì)文化生活及健康保障的要求越來越高，醫(yī)藥品的發(fā)展必將對藥品微生物質(zhì)量標準的制定、質(zhì)量監(jiān)督和檢測的任務(wù)提出更高的要求。,,理由（2） 無菌檢查是高風(fēng)險產(chǎn)品關(guān)乎用藥安全性的必檢項目，為

26、對所檢供試品的質(zhì)量負責(zé)，對檢驗質(zhì)量的負責(zé)，應(yīng)對檢出菌有一定的交代和證明。,,理由（3） 無菌檢查法前言中：“若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定,僅表明供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染?！?——那么，若供試品不符合無菌檢查法的規(guī)定，是否就能表明絕對是供試品污染所致？ 怎么證明？確定是供試品污染所致？,理由（4） 全國微生物重點實驗室的建立和發(fā)展，以及現(xiàn)有微生物檢定能力的證明，是藥典增加檢出菌檢定規(guī)

27、定的基礎(chǔ)建設(shè)和技術(shù)支撐。,相信隨著科技的進步、國家對藥品安全的關(guān)注，以及我們對無菌檢查法的深入研究和微生物檢定能力的發(fā)展，藥典無菌檢查法中增加對檢出菌的檢定要求是必須的，也是能夠做到的??！,,,,,,三、對每種接種后的培養(yǎng)基分別置兩種溫度下培養(yǎng) ——適合細菌生長的溫度和適合真菌生長的溫度， 使可能接種到某一培養(yǎng)基中去的菌都能得到適宜的生長溫度，增加撿出率。,四、各論化中無菌檢查表述的進一步規(guī)范化 見上