細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

1、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法,,,2011.03,一、基本概念,細(xì)菌內(nèi)毒素與熱原的關(guān)系熱原(Progen) 指臨床上能使哺乳類動(dòng)物產(chǎn)生熱原反應(yīng)的物質(zhì)。關(guān)于熱原的定義在學(xué)術(shù)上還有爭(zhēng)論。細(xì)菌內(nèi)毒素(Endotxin) 革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的構(gòu)成成分，具有多種生物活性，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是脂多糖(LPS)。熱原與內(nèi)毒素的關(guān)系在學(xué)術(shù)上仍有爭(zhēng)論，但在GMP的條件下，在藥檢的范疇里，內(nèi)毒素是主要的熱原物質(zhì)，可以說無內(nèi)毒素就無熱原，控制內(nèi)毒素就控制熱原

2、。,一、基本概念,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法系利用鱟試劑來檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中的細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方式，即凝膠法和光度測(cè)定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測(cè)時(shí)，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測(cè)定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法為準(zhǔn)。,一、基本概念,細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位(EU或IU)表示。細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標(biāo)定、

3、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià)，用于試驗(yàn)中的鱟試劑靈敏 度復(fù)核、干擾試驗(yàn)及各種陽性對(duì)照。,一、基本概念,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝膠法）或0.005EU/ml（用于光度測(cè)定法）且對(duì)內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾的滅菌注射用水。試驗(yàn)所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。常用的方法是在250℃干烤30分鐘以上，也可以

4、采用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。試驗(yàn)操作過程應(yīng)防止微生物的污染。,二、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(凝膠限量法),細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（凝膠法）實(shí)驗(yàn)程序如下：一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：試劑、儀器、及用具等二、確定藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）三、計(jì)算供試品的最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）或最低有效濃度（MVC）四、鱟試劑靈敏度復(fù)核五、藥品與鱟試劑相容性的初篩試驗(yàn)六、供試品干擾試驗(yàn)以及干擾試驗(yàn)的驗(yàn)證七、供試品日常的內(nèi)毒素限量檢查。,三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備,

5、1. 儀器、設(shè)備 37±1℃恒溫水浴或適宜的恒溫器具2.器具：凡與供試品或試劑直接接觸的器具必須經(jīng)除熱原處理（250℃干烤30min以上）;塑料用具須確證不干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果. 3.試劑 內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品、 鱟試劑、 鱟試驗(yàn)用水、 PH調(diào)節(jié)劑。,四、確定藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）,L =K/M L:供試品的內(nèi)毒素限值,可從《藥典》上查詢或按以上公式計(jì)算,以EU/ml、EU/mg、EU/U表示K:按照規(guī)定

6、的給藥途徑,人體每公斤體重每小時(shí)可接受的最大內(nèi)毒素劑量,以EU/(kg.h)表示;M:人體每公斤體重每小時(shí)最大用藥劑量,以ml／(kg.h)、mg／(kg.h)或U／(kg.h)表示，中國人均體重按60公斤計(jì)算，人體表面積按1.62m2計(jì)算。按注射時(shí)間若不足1小時(shí)，按1小時(shí)計(jì)算。供試品每平方米體表劑量乘以0.027即可轉(zhuǎn)換為每千克體重劑量（M)。,五、鱟試劑靈敏度復(fù)核,1.鱟試劑靈敏度定義：在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)

7、毒素的最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，用EU/ml表示。2.目的 2.1考察鱟試劑靈敏度和細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)是否準(zhǔn)確， 2.2考察試驗(yàn)人員操作方法是否正確和試驗(yàn)條件是否符合規(guī)定。3.鱟試劑靈敏度復(fù)核的條件 3.1使用新批號(hào)的鱟試劑， 3.2試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)。,五、鱟試劑靈敏度復(fù)核,4.溶液配制 注：A 為內(nèi)毒素水溶液系列；B為

8、陰性對(duì)照,五、鱟試劑靈敏度復(fù)核,5.反應(yīng)加樣6.結(jié)果判斷：反應(yīng)管倒轉(zhuǎn)180° 陽性(+)：凝膠不變形，不從管壁滑脫者 陰性(-)：無凝膠或凝膠不能保持完整，從管壁滑脫者,五、鱟試劑靈敏度復(fù)核,試驗(yàn)有效性判斷 NC管必須全部為陰性(- -) TAL與內(nèi)毒素水溶液系列： 2λ管均為陽性(+ + + +)， 0.25λ管均為陰性(- - - - ) 符合以上條件試驗(yàn)有效,五

9、、鱟試劑靈敏度復(fù)核,結(jié)果計(jì)算 鱟試劑靈敏度的測(cè)定值(λc)計(jì)算： λc =antilg(∑X／4) X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值(lg)。 反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽性結(jié)果的濃度。當(dāng)0.5λ≤λc≤2λ時(shí)，以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。,六、鱟試劑靈敏度的選擇,一般為了試驗(yàn)的方便，選擇靈敏度低的鱟試劑，若供試品的限值很小，則應(yīng)選擇靈敏度高的鱟試劑，方便供試品溶液的稀釋和PPC（供試

10、品陽性對(duì)照）的制備。,七、供試品溶液的制備,供試品溶液的最大稀釋倍數(shù)的計(jì)算 MVD＝CL/λ L:供試品的內(nèi)毒素限值； C：供試品溶液的濃度； 當(dāng)L以 EU/ml表示時(shí)，C為1ml/ml;當(dāng)L以EU/mg或EU/u表示時(shí)，C的單位為mg/ml或u/ml(注意：當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，C的值不是樣品的濃度，就是1)。,七、供試品溶液的制備,某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試

11、品溶液的PH值在6.0～ 8.0的范圍內(nèi)。(USP、EP一般要求供試品溶液與鱟試劑的混合液的PH值在6.0～ 8.0的范圍內(nèi)。） 對(duì)于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需要調(diào)節(jié)被測(cè)溶液(或其稀釋液)的PH值。,八、藥品與鱟試劑相容性初篩試驗(yàn),1.目的： 通過一系列濃度的試驗(yàn)，篩選出對(duì)鱟試驗(yàn)無干擾的濃度 2.作用： 確定以后對(duì)樣品作BET常規(guī)檢查的兩個(gè)主要參數(shù)： 樣品的有效稀釋范圍或有效濃度范圍，

12、可選擇的鱟試劑的靈敏度范圍。 減少干擾試驗(yàn)的盲目性 節(jié)省時(shí)間以及成本。,九、供試品的干擾試驗(yàn),1.目的：判斷某種檢品在某種濃度下是否適合作內(nèi)毒素檢查。 2.原理：比較鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)在水溶液中進(jìn)行和在檢品中進(jìn)行的差異,也即是比較反應(yīng)在不同介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)的差異,無差異即無干擾,有差異即有干擾。若沒有干擾，該濃度可以進(jìn)行日常檢查；若有干擾，則必須排除干擾后才能進(jìn)行日常檢查。,九、供試品的干擾試驗(yàn),3.在何種情況下需做干擾試驗(yàn)

13、： 新品種建立方法 鱟試劑的來源改變 鱟試劑的配方、生產(chǎn)工藝改變 供試品的來源改變 供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變 試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了其它有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化。,九、供試品的干擾試驗(yàn),注：A為陰性對(duì)照；B為干擾試驗(yàn)系列；C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對(duì)照系列；D為供試品溶液 ① USP、EP規(guī)定為4支平行管,凝膠法干擾試驗(yàn)溶液的制備,九、供試品的干擾試驗(yàn),加樣反應(yīng),十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析,試驗(yàn)有效性判斷 --

14、-NC管必須全部為陰性 ---供試品管必須為陰性 ---TAL與內(nèi)毒素水溶液系列： 2λ管均為陽性(++++)， 0.25λ管均為陰性(- - - - ) 即0.5λ≤Es≤2λ 符合以上條件試驗(yàn)有效。,λ,十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析,按下式計(jì)算系列溶液C和溶液B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值(Es和Et) Es=antilg(∑Xs／4) Et=antilg(∑Xt／4) Xs和Xt

15、分別為系列溶液C和溶液B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值(lg)。當(dāng)0.5λ≤Es≤2λ且0.5Es≤Et≤2Es 時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。 USP、EP規(guī)定當(dāng)0.5λ≤Es≤2λ且0.5λ≤Et≤2λ時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。,十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析,反應(yīng)結(jié)果1(SD表示供試品溶液)E0.5 E0. 25 E0.125 E0.06 NC Es ++++ ++++

16、 - - - - - - - - - - 0.25Eu／mlSDE0.5 SDE0. 25 SDE0.125 SDE0.06 NPC Et ++++ ++++ - - - - - - - - - - 0.25Eu／ml 0.5λ≤ Es ≤ 2λ且Es=Et,干擾成立,十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析,反應(yīng)結(jié)果2：E0.5 E0. 25

17、 E0.125 E0.06 NC Es ++++ ++++ ++++ - - - - - - 0.125Eu／mlSDE0.5 SDE0. 25 SDE0.125 SDE0.06 NPC Et ++++ ++++ - - - - - - - - - - 0.25Eu／ml 0.5λ≤ Es ≤

18、 2λ且Et=2Es,干擾成立,十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析,反應(yīng)結(jié)果3：E0.5 E0. 25 E0.125 E0.06 NC Es ++++ ++++ - - - - - - - - - - 0.25Eu／mlSDE0.5 SDE0. 25 SDE0.125 SDE0.06 NPC Et ++++ ++++

19、 ++++ - - - - - - 0.125Eu／ml 0.5λ≤ Es ≤ 2λ且 Et =0.5Es,干擾成立,十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析,反應(yīng)結(jié)果4：增強(qiáng)E0.5 E0. 25 E0.125 E0.06 NC Es ++++ ++++ - - - - - - - - - - 0.25Eu

20、／mlSDE0.5 SDE0. 25 SDE0.125 SDE0.06 NPC Et ++++ ++++ ++++ +- - - - - 0.104Eu／ml按中國藥典判斷：試驗(yàn)有效，但內(nèi)毒素供試品溶液系列不符合 0.5Es≤Et≤2Es ，則認(rèn)為干擾試驗(yàn)不成立，即供試品在試驗(yàn)濃度下有干擾作用。 按USP、EP判斷:內(nèi)毒素供試品溶液系列0.25λ管（SDE0.

21、5）中有一管呈陽性,不符合0.5λ≤Et≤2λ的要求,則認(rèn)為干擾試驗(yàn)不成立，即供試品在試驗(yàn)濃度下有干擾作用。,十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析,反應(yīng)結(jié)果5：增強(qiáng)E0.5 E0. 25 E0.125 E0.06 NC Es ++++ ++++ ++++ - - - - - - 0.125Eu／mlSDE0.5 SDE0. 25 SDE0.125

22、SDE0.06 NPC Et ++++ ++++ ++++ +- - - - - 0.104Eu／ml按中國藥典判斷:試驗(yàn)有效，符合 0.5λ≤Es≤2λ且0.5Es≤Et≤2Es ，則認(rèn)為干擾試驗(yàn)成立,即供試品在試驗(yàn)濃度下無干擾作用。按USP、EP判斷: 內(nèi)毒素供試品溶液系列0.25λ管（SDE0.5）中有一管呈陽性,不符合0.5λ≤Et≤2λ的要求 ，則認(rèn)為干擾試驗(yàn)不成立

23、,即供試品在試驗(yàn)濃度下有干擾作用。,十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析,反應(yīng)結(jié)果6：抑制E0.5 E0. 25 E0.125 E0.06 NC ++++ ++++ - - - - - - - - - -SDE0.5 SDE0. 25 SDE0.125 SDE0.06 NPC +++- - - - - - - - - - - - -

24、 - -　內(nèi)毒素供試品溶液系列2λ管（SDE0.5）中有一管呈陰性，供試品在該濃度下對(duì)凝膠反應(yīng)有抑制作用。,十、干擾試驗(yàn)結(jié)果分析,反應(yīng)結(jié)果7：抑制E0.5 E0. 25 E0.125 E0.06 NC Es ++++ ++++ ++++ - - - - - - 0.125Eu／mlSDE0.5 SDE0. 25 SDE0.125 S

25、DE0.06 NPC Et ++++ - - - - - - - - - - - - - - 0.5Eu／ml按中國藥典:0.5λ≤ Es ≤ 2λ但 Et ＞2Es,干擾不成立。認(rèn)為供試品在試驗(yàn)濃度下對(duì)凝膠反應(yīng)有抑制作用.按USP、EP:0.5λ≤ Es ≤ 2λ且0.5λ≤ Et ≤ 2λ 干擾成立。認(rèn)為供試品在試驗(yàn)濃度下對(duì)凝膠反應(yīng)無干擾作用.,十一、舉例：某產(chǎn)品的干擾試驗(yàn),1.試

26、劑,十一、舉例：某產(chǎn)品的干擾試驗(yàn),2.制備某產(chǎn)品供試品溶液某產(chǎn)品內(nèi)毒素限值L≤0.6EU/mg最大有效稀釋倍數(shù)MVD=(4mg/ml×0.6EU/mg)/0.25EU/ml=9.6選擇稀釋倍數(shù)為8倍,則其供試液的濃度為0.5mg/ml。供試液(S8)的制備 2.0ml供試品+13.4mlBET水+0.6mlOH-,PH=7.0,十一、舉例：某產(chǎn)品的干擾試驗(yàn),3.內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和內(nèi)毒素

27、供試品溶液的制備：分別用鱟試劑和供試品溶液將同一支內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品按以下步驟稀釋： 0.2ml 0.2ml 1.0ml,150EU/ml 15EU/ml 1.5EU/ml 0.5EU/ml,1.8ml,1.8ml,2.0ml,1.0ml,1.

28、0ml,1.0ml,1.0ml,0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.06EU/ml,,,,,,,1.0ml,1.0ml,十一、舉例：某產(chǎn)品的干擾試驗(yàn),4.反應(yīng)結(jié)果,十一、舉例：某產(chǎn)品的干擾試驗(yàn),5.結(jié)果分析試驗(yàn)有效性判斷： NC管必須全部為陰性 NPC管必須全部為陰性 TAL與內(nèi)毒素水溶液系列： 2λ管均為陽性(++++)，0.25λ管均為陰性(- - - - )

29、 試驗(yàn)結(jié)果符合以上條件，試驗(yàn)有效。,λ,十一、舉例：某產(chǎn)品的干擾試驗(yàn),按下式計(jì)算系列溶液C和溶液B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值(Es和Et) Es=antilg(∑Xs／4) =antilg［(lg0.25Eu／ml×4)／4］=0.25Eu／ml Et=antilg (∑Xt／4) =antilg［(lg0.25Eu／ml×3+lg0.5Eu／ml)／4］=0

30、.297Eu／ml0.5λ≤Es≤2λ且0.5Es≤Et≤2Es ，供試品在0.5mg／ml濃度下無干擾作用。,十二、消除干擾的方法,供試品若經(jīng)干擾試驗(yàn)證實(shí)存在干擾因素，可采用適宜的方法來消除干擾。消除干擾的一個(gè)重要原則是不能影響供試品中的內(nèi)毒素生物活性。 1.供試品稀釋法 MVD=CL /λ 鱟試劑靈敏度(λ)越高(數(shù)值越小)，供試品的稀釋倍數(shù)越大，干擾越小。,十二、消除干擾的方法,2.物理方法 如加熱法(血

31、液制品)、冷析法(甘露醇 ) 3.化學(xué)方法 如調(diào)節(jié)PH值(奎諾酮類)、調(diào)節(jié)金屬離子(血液保養(yǎng)液、FDP) 4.生物方法 如抗增液的使用，阻斷G因子反應(yīng)，防止假陽性； 5.其它方法 如過濾法、溶劑抽提等,十三、檢品的日常檢查,1.經(jīng)過干擾試驗(yàn)的驗(yàn)證后，則可進(jìn)行檢品的日常內(nèi)毒素檢查，檢查法的反應(yīng)管按以下設(shè)置： 注：A為供試品溶液；B供試品陽性對(duì)照(PPC)；C為陽性對(duì)照(PC)；D為陰性對(duì)照(NC

32、),十三、檢品的日常檢查,2.加樣反應(yīng),十三、檢品的日常檢查,3.結(jié)果判斷,十四、注意事項(xiàng),防止鱟試驗(yàn)用水被污染開啟內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品和鱟試劑時(shí)，要將粘附在安瓿壁上的粉末盡可能地彈落下去。用砂輪劃過安瓿后，要用酒精棉（最好能用沾異丙醇的無紡布，以避免產(chǎn)生假陽性結(jié)果）擦拭，防止開啟時(shí)玻璃屑落入安瓿內(nèi)。開啟內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，要在安瓿曲頸上部，并盡可能保留較長(zhǎng)的安瓿頸，準(zhǔn)確加入1.0ml鱟試驗(yàn)用水復(fù)溶。,十四、注意事項(xiàng),細(xì)菌內(nèi)毒素要充分混合均勻1

33、.內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶解后要在旋渦混合器混合15分鐘，以后的每一步稀釋前要至少混合30秒，其它國家藥典也有類似要求；2.具有兩極活性的內(nèi)毒素分子在水中呈現(xiàn)不均勻分布。3.不按要求進(jìn)行旋渦混合器混合會(huì)使所稀釋的內(nèi)毒素效價(jià)偏低，造成靈敏度標(biāo)示偏高、陽性對(duì)照不凝等不正確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。,十四、注意事項(xiàng),對(duì)靈敏度標(biāo)示值的誤解：如λ=0.06EU/ml，實(shí)際上表示的靈敏度λ=0.0625EU/ml，這樣寫是為了簡(jiǎn)便。稀釋過程中一定要按照λ