細(xì)菌與病毒的微生物學(xué)檢查法

1、第七章細(xì)菌與病毒的微生物學(xué)檢查法,微生物學(xué)教研室Jiz-Zhaoj12zhao@aliyun.com,教學(xué)大綱,掌握內(nèi)容標(biāo)本的采集和送檢原則病原菌的檢驗(yàn)程序細(xì)菌感染的血清學(xué)診斷及常用方法了解內(nèi)容病原體的抗原成分、核酸及其他成分的檢測方法,病原學(xué)檢查的目的,進(jìn)行病因?qū)W診斷指導(dǎo)合理用藥觀察治療進(jìn)行傳染病的流行病學(xué)調(diào)查,,標(biāo)本的采集和送檢六原則※,無菌操作：避免雜菌污染,不同期不同標(biāo)本,用抗生素以前,采集病變明顯部位,

2、,,,,,,,,,,,,運(yùn)送注意保存,采集雙份血清,第一節(jié) 細(xì)菌感染的微生物學(xué)檢查法,可疑細(xì)菌感染,,采集標(biāo)本,,,血清學(xué)實(shí)驗(yàn)雙份血清,直接形態(tài)學(xué)檢查,細(xì)菌成分檢測,,特異性抗體檢測,,細(xì)菌分離培養(yǎng),,鑒定,,,形態(tài)學(xué)檢查生化學(xué)檢查血清學(xué)鑒定藥物敏感實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（毒力）實(shí)驗(yàn),,,抗原檢測,核酸檢測,,,直接凝集實(shí)驗(yàn)協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn)乳膠凝集實(shí)驗(yàn)免疫熒光檢測ELISA等,核酸雜交聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）DNA芯片,凝集反應(yīng)沉

3、淀反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中和試驗(yàn)ELISA等,,,,,,,細(xì)菌學(xué) 診斷,檢測病原菌成分,檢測患者血清中特異性抗體,,細(xì)菌病原學(xué)檢查法,形態(tài)學(xué)檢查分離培養(yǎng),純培養(yǎng)生化試驗(yàn)血清學(xué)鑒定藥物敏感試驗(yàn)毒力實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),,抗原,核酸,一、細(xì)菌學(xué)診斷,（一）形態(tài)學(xué)檢查,光學(xué)顯微鏡檢查法：細(xì)菌染色檢查法革蘭染色法抗酸染色法負(fù)染法暗視野檢查：用于檢查活菌、螺旋體及其動(dòng)力熒光顯微鏡,腦脊液的直接涂片染色-肺炎鏈球菌,,鏈球菌,淋

4、病奈瑟球菌-膿液直接涂片,結(jié)核分枝桿菌,霍亂弧菌,,暗視野顯微鏡,鉤端螺旋體,肺炎雙球菌,病原菌的分離培養(yǎng)/直接涂片,大小形態(tài)顏色表面性狀透明度溶血性,Flame sterilize wire loop, metal forceps, etc before and after use in a hooded Bunsen burner,細(xì)菌動(dòng)力的檢測,化膿性球菌,葡萄球菌,鏈球菌,腸道桿菌,大腸埃希菌,沙門氏菌,志賀菌,細(xì)菌形

5、態(tài)無特異性可采用生化學(xué)檢查法-鑒別細(xì)菌的重要方法,（二）生化試驗(yàn),糖發(fā)酵試驗(yàn) H2S試驗(yàn) 枸櫞鹽利用試驗(yàn),鑒定中最重要的生化反應(yīng)※,乳糖發(fā)酵試驗(yàn),腸道非致病菌（埃希菌屬）發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣＋,腸道致病菌（志賀菌屬、沙門菌屬等）不發(fā)酵乳糖 —,,,,,（三）血清學(xué)鑒定,利用含已知的特異性抗體的免疫血清，檢測未知的細(xì)菌抗原，對細(xì)菌進(jìn)行種的鑒定 志賀菌屬、沙門菌屬常用方法是玻片凝集試驗(yàn),測定抗生素或其他抗微

6、生物制劑在體外抑制細(xì)菌生長的能力方法： 擴(kuò)散法、稀釋法,（四）藥物敏感試驗(yàn),MIC & MBC,最低抑菌濃度，MIC最低殺菌濃度，MBC,全自動(dòng)分析儀,全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀,全自動(dòng)生化分析儀,（五）檢測毒力-動(dòng)物實(shí)驗(yàn),1. 常用動(dòng)物　 Mouse　Guinea Pig　 Rabbit Dog Monkey,接種途徑,皮內(nèi) 皮下 腹膜內(nèi) 靜脈 顱內(nèi) 椎管內(nèi) 鼻內(nèi) 灌胃,毒力檢測,半數(shù)致死量 LD50半

7、數(shù)感染量 ID50,二、檢測病原菌成分,抗原的檢測核酸的檢測,（一）抗原的檢測,利用已知的特異性Ab檢測Ag的方法常用的方法有玻片凝集協(xié)同凝集試驗(yàn)ELISA免疫熒光法,ELISA,（二）核酸檢測方法,聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）核酸雜交技術(shù)Southern blotNorthern blotDot blotIn situ hybridization基因芯片(Gene chip)16S rRNA,16sRNA基因序列

8、分析,只存在于原核細(xì)胞型微生物的染色體基因中16sRNA，23sRNA, 5sRNA可變區(qū)和保守區(qū)保守區(qū)：所有的細(xì)菌所共有可變區(qū)：屬和種的特異性,PCR,Gene Chip,,,三、抗體的檢測,用已知細(xì)菌或其Ag檢測相應(yīng)的特異性Ab及其量的多少，作為某些病原菌感染的輔助診斷急性期和恢復(fù)期雙份血清，恢復(fù)期效價(jià)升高≥4倍有診斷價(jià)值方法玻片或試管凝集試驗(yàn)、沉淀試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、 冷凝集試驗(yàn)、ELISA局限難以早期

9、診斷,第二節(jié) 病毒感染的微生物學(xué)檢查法,形態(tài)學(xué)病毒的分離鑒定在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的鑒定指標(biāo)病毒成分的檢測病毒抗體的檢測,,（一）病毒的形態(tài)學(xué)檢查,電子顯微鏡（ EM） 免疫電鏡, IEM光學(xué)顯微鏡（CM）包涵體內(nèi)基小體（Negri body）,HAV,Negri body,動(dòng)物接種：動(dòng)物模型,雞胚接種： 9～14d,組織培養(yǎng),器官培養(yǎng),組織培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng),原代細(xì)胞培養(yǎng),,二倍體細(xì)胞培養(yǎng),傳代細(xì)胞培養(yǎng),三大培養(yǎng)方法,（二）病毒

10、的分離培養(yǎng)的方法,,,血凝抑制實(shí)驗(yàn)中和實(shí)驗(yàn)PCR檢測,,,,病毒分離培養(yǎng)及鑒,細(xì)胞病變（cytopathy) ※紅細(xì)胞吸附 (hemadsorption)病毒干擾作用 (viral interference)中和試驗(yàn) (neutralization test, NT)空斑形成試驗(yàn) (plaque formation),病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的鑒定指標(biāo)※,細(xì)胞病變—細(xì)胞病變效應(yīng)※（CPE）,細(xì)胞病變紅細(xì)胞吸附：血凝素（HA）

11、病毒干擾作用中和試驗(yàn)病毒數(shù)量及感染性的檢測空斑形成試驗(yàn)紅細(xì)胞凝集,紅細(xì)胞吸附,病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的鑒定指標(biāo),,plaque,空斑形成試驗(yàn),用于病毒濃度的精確定量和測定抗病毒藥物的作用一個(gè)空斑是由一個(gè)病毒大量復(fù)制而成，稱為空斑形成單位（Plaque forming unit，PFU）。病毒的感染量用PFU/ml表示,（三）病毒成分的檢測,病毒抗原的檢測: ELISA 病毒核酸的檢測 核酸雜交、PCR、 基因芯片,

12、病毒成分的檢測,（四）病毒抗體的檢測,中和試驗(yàn)（NT）血凝抑制試驗(yàn)（HT）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CF）ELISA法蛋白印跡技術(shù),小 結(jié),細(xì)菌感染的微生物學(xué)檢查法病原體檢查核酸的檢測抗原、抗體的檢測病毒感染的微生物學(xué)檢查法電鏡及免疫電鏡病毒的分離培養(yǎng)和鑒定核酸的檢測抗原、抗體的檢測,小結(jié),抗細(xì)菌免疫固有免疫※獲得性免疫抗病毒免疫固有免疫干擾素※獲得性免疫,問 題,采集標(biāo)本的原則？病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的鑒定指

13、標(biāo)？干擾素的概念及其抗病毒機(jī)制,自檢內(nèi)容,1. 機(jī)體抗結(jié)核分枝桿菌的感染免疫主要依賴A. 屏障結(jié)構(gòu) B. 細(xì)胞免疫 C.抗體的中和作用D.非特異性免疫分子 E. 吞噬細(xì)胞的吞噬作用2. 滅活和清除游離病毒主要依靠A.干擾素 B.抗體 C.細(xì)胞因子 D.非特異性免疫分子 E.皮膚粘膜屏障,自檢內(nèi)容,3. 抑制病毒的增殖，保護(hù)鄰近細(xì)胞免疫受病毒感染的抗病毒作用機(jī)制是 A. 抗體 B. NK細(xì)胞 C.細(xì)胞因子 D.干擾素 E.C