豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒雙重RT-PCR檢測(cè)方法的建立和初步應(yīng)用.pdf

1、豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，豬不分年齡、性別和品種均易感染，一年四季均可發(fā)生。我國(guó)是世界上養(yǎng)豬最多的國(guó)家也是豬瘟流行嚴(yán)重的國(guó)家之一，由豬瘟致死的豬占因各種疾病豬死亡總數(shù)的1/3，每年的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億元，其嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。而目前對(duì)于豬瘟的治療措施主要是疫苗接種免疫。我國(guó)在上個(gè)世紀(jì)50年代成功培育出了豬瘟兔化弱毒疫苗C株，事實(shí)證明該疫苗對(duì)于控制我國(guó)和世界

2、上其他國(guó)家的豬瘟疫情起到了重大作用，是國(guó)際公認(rèn)的安全有效的弱毒活疫苗。在豬瘟細(xì)胞苗的生產(chǎn)中需要牛睪丸細(xì)胞(NBTE)來(lái)繁殖豬瘟病毒，且在細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中需要加入胎牛血清提供營(yíng)養(yǎng)，因此有可能將牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea，BVD)這種外源病毒帶入豬瘟細(xì)胞苗中。另外，用含BVDV抗體的胎牛血清也會(huì)干擾豬瘟病毒的體外培養(yǎng)。BVD與豬瘟CSF同屬于瘟病毒屬，BVD不僅可以感染牛，還可以感染豬，引起的臨床表現(xiàn)與CSF

3、相似。由于細(xì)胞苗的大規(guī)模的生產(chǎn)和使用，為保證在細(xì)胞苗的生產(chǎn)過(guò)程和最終產(chǎn)品的安全性和有效性。同時(shí)鑒于這兩種疾病的臨床表現(xiàn)非常相似，臨床診斷容易引起混淆，早期的鑒別診斷對(duì)控制這兩種疾病顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)建立了一種快速、敏感、特異的檢測(cè)CSFV和BVDV的雙重RT-PCR方法，并且應(yīng)用該方法對(duì)牛睪丸細(xì)胞、胎牛血清、豬瘟細(xì)胞苗及臨床病料進(jìn)行檢測(cè)。
　　 ⑴檢測(cè)CSFV和BVDV雙重RT-PCR方法的建立。參照GeneBank收錄的豬瘟

4、強(qiáng)弱毒序列進(jìn)行對(duì)比，重點(diǎn)關(guān)注豬瘟兔化弱毒C株；BVDV主要參考標(biāo)準(zhǔn)毒株NADL株，同時(shí)兼顧其它的1型為主，對(duì)2型不能通用。找出CSFV和1型BVDV的基因序列差異較大的區(qū)域，同時(shí)兼顧同一病毒不同毒株的相對(duì)保守區(qū)域，設(shè)計(jì)合成了鑒別CSFV和BVDV的兩對(duì)特異性引物。通過(guò)優(yōu)化退火溫度、Taq酶濃度等，建立了檢測(cè)CSFV和BVDV的雙重RT-PCR方法。應(yīng)用該方法能擴(kuò)增出大小約為938bp和650bp的目的片段。經(jīng)過(guò)序列分析、敏感性試驗(yàn)、特異

5、性試驗(yàn)和可重復(fù)性試驗(yàn)表明該雙重RT-PCR方法可用于細(xì)胞、血清、疫苗和臨床病料等的檢測(cè)。
　　 ⑵CSFV和BVDV雙重RT-PCR方法的應(yīng)用。利用建立的CSFV和BVDV的雙重RT-PCR方法對(duì)采集的11個(gè)批次牛睪丸細(xì)胞、不同廠家的7個(gè)批次的胎牛血清、6家不同生物制品廠生產(chǎn)的60個(gè)批次的豬瘟細(xì)胞苗、以及廣東送檢的某豬場(chǎng)10個(gè)全血樣品和相對(duì)應(yīng)的10個(gè)扁桃體樣品進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明目前我們公司所采集的11批牛睪丸細(xì)胞和采購(gòu)的不同

6、廠家7個(gè)批次的胎牛血清均不存在BVDV污染的情況；6家不同生物制品廠的60個(gè)批次的豬瘟細(xì)胞苗也不存在BVDV污染，說(shuō)明目前各個(gè)胎牛血清制品廠家和6家生物制品廠家對(duì)BVDV相當(dāng)?shù)闹匾暋?duì)于廣東某豬場(chǎng)送檢的樣品進(jìn)行比較檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在10個(gè)全血樣中檢測(cè)不到CSFV和BVDV其中任何一種病毒，檢出率為0；而從對(duì)應(yīng)的10個(gè)扁桃體樣品中4個(gè)樣品檢測(cè)出了BVDV，檢出率為40％，說(shuō)明這個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)存在BVDV感染現(xiàn)象。從一個(gè)側(cè)面反映了不同的樣品存在不同的檢