豬病毒性腹瀉多重RT-PCR診斷方法的建立和應(yīng)用及豬輪狀病毒的分離.pdf

1、在寒冷季節(jié)，豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬A群輪狀病毒(PGAR)是引起豬腹瀉的主要病原，其臨床癥狀、病理變化和流行病學(xué)極為相似，在臨床和組織病理學(xué)上很難區(qū)分。本試驗(yàn)建立了能同時(shí)檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬A群輪狀病毒(PGAR)的多重RT-PCR檢測(cè)方法。根據(jù)GenBank登錄的PEDVM基因、TGEVN基因、PGARVP7基因，利用軟件Primer5.0設(shè)計(jì)合

2、成三對(duì)特異性引物。經(jīng)條件優(yōu)化，我們建立了一種能夠同時(shí)檢測(cè)PEDV,TGEV和PGAR的多重RT-PCR的方法，并將這種方法和常規(guī)的RT-PCR進(jìn)行了比較。特異性試驗(yàn)中，多重RT-PCR檢測(cè)方法能夠檢測(cè)到35pg的TGEV-PEDV-PGAR三聯(lián)苗的混合RNA。在臨床檢測(cè)中，應(yīng)用該方法檢測(cè)了華中地區(qū)75份腹瀉豬糞樣，同時(shí)利用常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)該檢測(cè)方法的敏感性和特異性進(jìn)行了分析(PEDV、TGEV、PGAR敏感性分別為92％、10

3、0％、100％，特異性均為100％)。該方法敏感性高、特異性強(qiáng)，可用于腹瀉樣品中PEDV、TGEV和PGAR的檢測(cè)。
　　 利用已建立的PEDV、TGEV、PGAR多重RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)2009年1月至2010年2月來(lái)自湖北、河南、湖南、江西、廣西等地區(qū)部分養(yǎng)殖場(chǎng)的197份豬腹瀉糞樣進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果為PEDV感染58份，占29.44％；TGEV感染1份，占0.51％:PGAR感染15份，占7.61％。哺乳仔豬、保育及育肥豬和

4、母豬三個(gè)生長(zhǎng)階段進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析：在PEDV58份陽(yáng)性樣品中哺乳仔豬占24.14％、保育及育肥豬占55.17％、母豬占20.69％；TGEV僅從哺乳仔豬檢出、保育及育肥豬和母豬未檢測(cè)出：PGAR15份陽(yáng)性樣品中哺乳仔豬占13.33％、保育及育肥豬占6.67％、母豬占80.00％。檢測(cè)結(jié)果顯示：在寒冷季節(jié)，在本次收集的腹瀉樣品中豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是引起不同生長(zhǎng)階段豬病毒性腹瀉最常見(jiàn)的病原，其次是豬A群輪狀病毒。
　　 將三

5、份輪狀病毒陽(yáng)性的腹瀉豬糞樣接種MA104細(xì)胞進(jìn)行了輪狀病毒分離，盲傳至第三代開(kāi)始出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變(CPE)，將分離毒株依次命名為：TM-a毒株、WH-a毒株和GX-a毒株。對(duì)分離病毒進(jìn)行了常規(guī)RT-PCR鑒定；同時(shí)依據(jù)GenBank發(fā)表的豬A群輪狀病毒的VP6和VP7基因序列各設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，對(duì)三株分離毒株的VP6和VP7基因序列進(jìn)行了克隆及序列分析。結(jié)果顯示TM-a株VP6基因與中國(guó)武漢人源A群R479毒株親緣關(guān)系更為接近(94.4％