影響牛病毒性腹瀉病毒復(fù)制的miRNAs的篩選及功能研究.pdf

1、牛病毒性腹瀉/黏膜病（bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD）是由牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus, BVDV）引起的接觸性傳染病，在全球分布廣泛，危害嚴(yán)重。關(guān)于 BVDV導(dǎo)致的持續(xù)性感染和免疫抑制發(fā)生的分子機(jī)制，尤其是 BVDV與宿主細(xì)胞之間相互作用關(guān)系尚沒有系統(tǒng)性的闡述。miRNAs是生物體內(nèi)在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵分子，由于其途徑的專

2、一性強(qiáng)以及效果明顯等特點(diǎn)，miRNAs及其靶位點(diǎn)已經(jīng)成為治療病毒性疾病的特效基因藥物設(shè)計(jì)的新亮點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室高通量測序檢測了 BVDV感染靶細(xì)胞MDBK后的miRNAs差異表達(dá)譜顯示：23個(gè)miRNAs的表達(dá)量顯著性升高；而通過生物學(xué)軟件預(yù)測得到三個(gè)靶向BVDV NADL全基因組的miRNAs,所以本研究以篩選出來的影響 BVDV復(fù)制的 miRNAs為研究對象，探究miRNAs影響B(tài)VDV-NADL復(fù)制的分子機(jī)制，進(jìn)而為闡述BVDV的持續(xù)

3、性感染的分子機(jī)制， BVDV防控新方法奠定理論基礎(chǔ)。
　　[目的]本研究以BVDV NADL為研究對象，根據(jù)BVDV NADL感染宿主細(xì)胞MDBK后miRNAs的差異探索miRNAs影響B(tài)VDV NADL復(fù)制的分子機(jī)制。（1）探究bta-miR-33a靶向 MDBK細(xì)胞中 BCL凋亡通路中 bim（Bcl-2 interacting mediator of cell death)基因從而影響 BVDV NADL復(fù)制的機(jī)制；（2）探

4、究bta-miR-302c靶向BVDV NADL NS5A基因從而影響B(tài)VDV NADL復(fù)制的機(jī)制；
　　[方法]（1）依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期高通量測序結(jié)果篩選合成22個(gè) miRNAs，轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞后感染BVDV NADL，篩選出抑制BVDV NADL復(fù)制的miRNAs；qRT-PCR擴(kuò)增 BVDV NADL E0基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；（2）生物學(xué)信息軟件預(yù)測bta-miR-33a的靶基因并用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證；qRT-PCR、W

5、estern blot、流式細(xì)胞儀等方法檢測bta-miR-33a的靶基因 bim蛋白的表達(dá)水平及凋亡率的變化；qRT-PCR檢測bta-miR-33a對BVDV NADL拷貝數(shù)的影響；構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記的bim基因過表達(dá)慢病毒載體；qRT-PCR、Western blot、流式細(xì)胞儀等方法檢測MDBK過表達(dá)bim基因后bta-miR-33a的靶基因 bim蛋白的表達(dá)水平及凋亡率的變化；qRT-PCR檢測 MDBK細(xì)胞過表達(dá) bi

6、m基因后 bta-miR-33a對BVDV NADL拷貝數(shù)的影響；（3）生物學(xué)信息軟件預(yù)測靶向BVDV NADL全基因組的 miRNAs并用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證；qRT-PCR檢測bta-miR-302c、bta-miR-205、bta-miR-497對 BVDV NADL拷貝數(shù)和對TCID50的影響；qRT-PCR、Western blot檢測感染BVDV NADL不同時(shí)間段后MDBK細(xì)胞中JAK-STAT通路中各個(gè)因子的表達(dá)水

7、平變化；qRT-PCR、Western blot檢測BVDV NADL感染和/或 bta-miR-302c轉(zhuǎn)染不同時(shí)間段后， MDBK細(xì)胞中JAK-STAT通路中各個(gè)因子的表達(dá)水平變化。
　　[結(jié)果]（1）bta-miR-33a、bta-miR-27a-5p、bta-miR-21*可以顯著的降低 BVDVNADL的復(fù)制水平；成功構(gòu)建BVDV NADL E0基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；（2）bta-miR-33a特異性靶向MDBK細(xì)胞中凋亡通路

8、中bim基因3’非翻譯區(qū)（untranslated region， UTR）；bta-miR-33a通過沉默bim基因的表達(dá)降低MDBK的凋亡率；bta-miR-33a通過靶向bim基因降低BVDV NADL的拷貝數(shù)；成功構(gòu)建過表達(dá)bim的慢病毒；bta-miR-33a轉(zhuǎn)染下調(diào)bim基因過表達(dá)的 MDBK細(xì)胞中的 bim蛋白表達(dá)水平；bta-miR-33a能特異性降低bim基因過表達(dá)的MDBK細(xì)胞中BVDV NADL的拷貝數(shù)；（3）bt

9、a-miR-302c特異性的靶向BVDV NADL的NS5A3’端；bta-miR-302c和bta-miR-205下調(diào)BVDV NADL E0的mRNA水平，bta-miR-497上調(diào)BVDV NADL E0的mRNA水平；隨著感染BVDV NADL的時(shí)間的增長，JAK-STAT通路中各個(gè)因子的表達(dá)水平逐漸升高；bta-miR-302c抑制JAK-STAT通路中各個(gè)因子的表達(dá)水平；
　　[結(jié)論]：bta-miR-33a負(fù)向調(diào)控細(xì)