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![犬瘟熱病毒ELISA和RT-PCR檢測方法的研究.pdf_第1頁](https://static.zsdocx.com/FlexPaper/FileRoot/2019-3/1/8/11ae9f68-c642-4109-9bd9-27176775b859/11ae9f68-c642-4109-9bd9-27176775b8591.gif)
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文檔簡介
1、犬瘟熱(Canine Distemper)是由犬瘟熱病毒(Canine Distemper Virus,CDV)引起犬和肉食目中許多動物的一種高度接觸性傳染病。該病的傳染性強,發(fā)病率高,本病診斷比較困難,傳統(tǒng)的檢測方法在靈敏性和特異性上存在一定局限性。另外,在犬瘟熱弱毒疫苗廣泛應(yīng)用的背景下,大多數(shù)犬的血清對犬瘟熱病毒呈陽性反應(yīng)。犬瘟熱是對實驗用犬危害最大的病毒病之一。建立現(xiàn)代實驗動物微生物學(xué)質(zhì)量監(jiān)測體系基本原則是對該病必須同時包括檢測病
2、原體和檢測抗體兩個方面,本實驗包括建立了檢測犬瘟熱病原體的RT-PCR方法和檢測抗體的ELISA方法,兩種檢測方法互相補充,綜合判定結(jié)果。研究工作可分為2個部分: 第一部分犬瘟熱病毒間接ELISA法檢測技術(shù)的建立與初步應(yīng)用 采用RT-PCR法擴增出犬瘟熱病毒標準疫苗株的融合蛋白基因(F基因)片段約1499bp,核衣殼蛋白基因(N基因)片段約825bp克隆到pMD18-T載體。酶切鑒定后用一對特異性的引物擴增約732b
3、p的F蛋白基因片段、830bp的N蛋白基因片段。這兩個基因定向克隆到原核表達載體pET-28a(+)中后,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21中,在37℃ 1.0mM IPTG誘導(dǎo)下,F(xiàn)蛋白基因、N蛋白基因片段獲得了良好表達。表達產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定,結(jié)果顯示其表達的融合蛋白大小分別為28KDa、33KDa,與預(yù)期值相符。誘導(dǎo)條件的改變(IPTG的濃度改變)對表達量影響不大。Western印跡顯示表達產(chǎn)物能被CDV抗體特異性識別,實驗結(jié)
4、果表明這兩種重組蛋白保留了天然蛋白的部分抗原性,為進一步研究犬瘟熱病毒及其檢測方法奠定基礎(chǔ)。利用pET-28a的 His·Tag,使目的蛋白得到較好的純化。簡易的棋盤滴定法確定抗原包被濃度:F蛋白為10μg/ml,N蛋白5μg/ml,以此建立間接ELISA法。用ELISA法檢測20份樣品血清兩種蛋白的檢測結(jié)果符合率為100%。另外對血清做一系列濃度稀釋,從中得出以F蛋白為抗原,樣品血清的平均稀釋度為1:1025;以N蛋白為抗原,樣品血清
5、的平均稀釋度為1:2630。 第二部分犬瘟熱病毒RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用 本研究通過特異性擴增CDV核蛋白基因保守序列,建立了檢測CDV核酸的RT-PCR法。用NDV、CPV、PRV、IBV進行特異性試驗,結(jié)果顯示該方法有較好的特異性。RT-PCR檢測的20份血樣中陽性、陰性結(jié)果與臨床試紙法檢測結(jié)果相同,而9份試紙檢測為可疑的樣品中有4份為陽性。結(jié)果表明該方法的靈敏性與特異性較高。 本研究成功地建
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