基因2型牛病毒性腹瀉病毒的分離與鑒定.pdf

1、牛病毒性腹瀉病(BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)引起牛以腹瀉,急、慢性黏膜病,持續(xù)性感染,母畜流產(chǎn)、死胎和畸形胎等為臨床特征的一種重要的傳染病。BVDV呈世界性分布,其宿主譜相當(dāng)廣,除了可以感染各個(gè)年齡段的牛之外,還能感染豬、綿羊、山羊、鹿、駱駝及多種野生動(dòng)物,且其易感動(dòng)物群正呈逐漸擴(kuò)大的趨勢。
　　 BVDV有兩個(gè)基因型,即BVDV-1和BVDV-2。BVDV-1的發(fā)現(xiàn)早,分布比較普遍,流行于世界各個(gè)國家,而BVDV-

2、2在20世紀(jì)80年代末才首次分離于加拿大和美國爆發(fā)的急性BVD中。BVDV-1和BVDV-2感染表現(xiàn)的臨床癥狀很相似,但BVDV-2還能引起嚴(yán)重的血小板減少癥和出血綜合癥。我國在1980年首次分離報(bào)道了BVDV-1,隨后在各地區(qū)都相繼報(bào)道了該病毒的感染,目前,已有二十多個(gè)省市報(bào)道,說明BVDV-1在我國牛群流行普遍。2009年,我們實(shí)驗(yàn)室首次分離報(bào)道了BVDV-2,說明BVDV-2也開始出現(xiàn)在我國并可能流行。目前為止,關(guān)于BVDV-2在

3、我國流行的詳實(shí)情況還不是很清楚,該方面數(shù)據(jù)比較少。因此,本研究將集中如下三部分:一、目前國內(nèi)BVDV的流行病學(xué)調(diào)查;二、對BVDV分離株的特性進(jìn)行研究;三、對BVDV分離株進(jìn)行基因測序分析及分型。上述研究旨在為目前我國牛病毒性腹瀉病毒的流行提供資料,豐富該方面的數(shù)據(jù),為進(jìn)一步研究針對BVDV-1和BVDV-2的疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 研究一:從我國各省不同地區(qū)的養(yǎng)牛場采集疑似BVDV感染牛的臨床病料組織(脾、淋巴結(jié)、心肌、血液等)

4、,共127份。將樣品初步處理后,用我們實(shí)驗(yàn)室建立的雙抗夾心ELISA檢測抗原。經(jīng)ELISA檢測為陽性的樣品接種于MDBK細(xì)胞,進(jìn)行病毒分離。樣品在MDBK細(xì)胞上經(jīng)3次傳代后取提RNA,設(shè)計(jì)針對BVDV-1、BVDV-2和針對BVDV-1和BVDV-2兩型的特異性引物,用我們實(shí)驗(yàn)室建立的RT-PCR方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,在所檢測的樣品中,BVDV-2陽性11份(8.66％),所檢病料中沒有檢出BVDV-1。上述研究表明,BVDV-2在我

5、國牛群中已有廣泛流行。
　　 研究二:經(jīng)檢測為BVDV2陽性的病料樣品接種MDBK細(xì)胞,獲得11株。BVDV-2野毒株。分離到的11株BVDV-2分別盲傳培養(yǎng)至18代時(shí)仍不見任何典型的細(xì)胞病變。間接免疫熒光試驗(yàn)證明分離的野毒株能與鼠源的重組BVDV-2 E2蛋白抗血清發(fā)生免疫反應(yīng),產(chǎn)生特異性胞內(nèi)熒光;而與針對BVDV-1 E2蛋白的單抗不發(fā)生反應(yīng)。將病毒感染的MDBK細(xì)胞制備超薄切片,電鏡觀察可見感染細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中有約60 nm

6、大小的病毒粒子;經(jīng)差速離心和20％蔗糖墊底超速離心純化病毒,將提純的病毒經(jīng)磷鎢酸染色,在電鏡下能觀察到大小約60 nm有囊膜的病毒顆粒。
　　 研究三:提取病毒RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)針對BVDV5'-UTR、Npro、E2和NS2-3的引物,以cDNA為模板分別擴(kuò)增分離株的5'-UTR、Npro、E2和NS2-3基因片段。采用“TA”克隆法,將所擴(kuò)增的片段連接到PMD18-T Vector上,經(jīng)轉(zhuǎn)化篩選出陽性克隆,并送

7、去測序。通過5'-UTR序列進(jìn)化樹分析,結(jié)果表明11株分離株均為BVDV-2。比較這11株分離株的Npro、E2和NS2-3基因與GenBank中已發(fā)表的BVDV序列的同源性,結(jié)果表明,我們的這11株分離株的Npro、E2和NS2-3基因與890、XJ-04、p11Q、p24515、NewYork'93、NADL、Osloss、CD7、1373、SD-1、KS86-1ncp、Oregon C24V毒株的Npro、E2和NS2-3基因的核