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文檔簡介
1、豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus,PEDV)引起的一種嚴重的病毒性傳染病。該病毒屬于尼多病毒目,冠狀病毒科,冠狀病毒屬成員,可以引起新生仔豬嚴重的嘔吐、腹瀉、脫水為主要特征的高度接觸性腸道傳染病,各個年齡階段的豬群都會發(fā)病,哺乳仔豬病死率高達100%。自2010年冬季以來,新生哺乳仔豬的腹瀉病開始在全國各地規(guī)?;i
2、場暴發(fā),本次流行的腹瀉病具有發(fā)病日齡早、死亡率高的新特點。為此本研究在2013-2014年黑龍江省6個地級市的10座規(guī)?;i場采取新生哺乳仔豬臨床表現(xiàn)為腹瀉癥狀的糞便與小腸進行實驗室RT-PCR病原檢測分析,結(jié)果表明黑龍江省地區(qū)規(guī)?;i場新生仔豬PEDV RT-PCR檢出率為56%,PEDV+TGEVRT-PCR檢出率為6%,PRV RT-PCR檢出率為10%,TGEV RT-PCR檢出率為10%,表明引起黑龍江省規(guī)模化豬場新生仔豬腹瀉
3、的主要病原是PEDV,同時也存在與其他腹瀉病毒的混合感染,由于PEDV-M基因比較穩(wěn)定,是研究PEDV遺傳變異的優(yōu)先選擇基因,因此針對陽性病料擴增出6條PEDV-M基因序列進行遺傳進化分析,這6條PEDV-M基因序列之間的核苷酸同源性為98.2%~99%,與疫苗株CV777的核苷酸同源性為97.6%~98.2%。利用MEGA6.0進行遺傳進化樹的構(gòu)建,擴增出的6條PEDV-M基因的遺傳進化樹分為二個大系,大部分遺傳距離較近,處于同一分支
4、。其中LJJHD-M-13和LJJQ-M-14與泰國KU06RB08、泰國KU07RB08的親緣關(guān)系較近,LJJC-M-14、LJJJ-M-14、LJJH-M-13、LJMM-M-14這四株毒株與韓國M1595、韓國CPF259的親緣關(guān)系較近,同時擴增出的6條PEDV-M基因不與CV777毒株為一系,與其親緣性較遠。說明這些地區(qū)的PEDV流行毒株已經(jīng)發(fā)生變異,形成獨特的流行進化分支,因此新的疫苗毒株和免疫方法的研究對預(yù)防和控制該病具有重
5、要的意義。
本研究進一步建立了PEDV的RT-LAMP檢測方法。根據(jù)GenBank中發(fā)表的PEDV基因序列,用DNAstar軟件進行分析對比后,針對PEDV-N基因進行引物設(shè)計。利用PrimerExplorer5.0軟件設(shè)計引物,經(jīng)過嚴格篩選,最終確定一組引物,包括外引物F3、B3,內(nèi)引物FIP、BIP。用此引物對病毒RNA進行RT-LAMP反應(yīng),并對實驗反應(yīng)條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明,RT-LAMP檢測方法的最佳反應(yīng)條件為:反
6、應(yīng)溫度為61℃,反應(yīng)時間為50min,Mg2+2.5μL,dNTPs1.5μL,外引物和內(nèi)引物最佳濃度比為1∶4,即外引物(F3∶B3=1∶1)為1μL,內(nèi)引物(FIP∶ BIP=1∶1)為4μL。經(jīng)過靈敏性、特異性、穩(wěn)定性試驗,結(jié)果表明,RT-LAMP的敏感性是RT-PCR的100倍,特異性強,且穩(wěn)定性好。用本實驗建立的RT-LAMP方法對125份樣品提取的RNA進行檢測后,與RT-PCR方法檢測結(jié)果對比,二者符合率為100%,該檢測
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