牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的原核表達(dá)與巢式RT-PCR檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用.pdf

1、牛病毒性腹瀉(Bovineviraldiarrhea，BVD)是牛的主要疾病之一，可引起牛的生產(chǎn)性能下降而給養(yǎng)牛業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。牛病毒性腹瀉病毒基因組編碼11種蛋白，其中E2蛋白是病毒主要的保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，保護(hù)動(dòng)物不受同源毒株的攻擊。本試驗(yàn)用經(jīng)序列測(cè)定已知的牛病毒性腹瀉病毒BA毒株，接種MDBK細(xì)胞，提取病毒基因組RNA。根據(jù)BA毒株基因組序列，利用Oligo6生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)可以擴(kuò)增E2蛋白的一對(duì)引物，引入酶切位點(diǎn)

2、并去掉E2蛋白的跨膜區(qū)及疏水區(qū)。通過RT-PCR擴(kuò)增了長(zhǎng)約1000bp的E2基因片段，克隆到pMD18-T載體上，酶切并測(cè)序鑒定。然后將目的片段進(jìn)一步定向克隆到pET30a表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌。取轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)，并用IPTG誘導(dǎo)，獲得了以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白。將重組蛋白經(jīng)變性、純化、復(fù)性后，用Westernblotting、間接ELISA檢測(cè)表明純化的重組蛋白具有良好的免疫原性，為牛病毒性腹瀉病毒診斷試劑的研制奠定了基礎(chǔ)。

3、 同時(shí)利用GenBank中已發(fā)表的BVDV基因組序列中5'端保守序列設(shè)計(jì)巢式引物。應(yīng)用Oligo6軟件設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，一對(duì)為外部引物，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為294bp；一對(duì)為內(nèi)部引物，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1.54bp。經(jīng)過Blast對(duì)比分析，這一對(duì)引物可以檢測(cè)所有類型的BVDV、豬瘟病毒和邊界病病毒。應(yīng)用這兩對(duì)引物，建立了BVDV的巢式RT-PCR檢測(cè)方法。應(yīng)用該方法檢測(cè)了現(xiàn)地采集的牛血清、商品化的細(xì)胞培養(yǎng)用新生牛血清和成年牛血清、流產(chǎn)牛胎

4、兒組織等樣品，結(jié)合核苷酸序列分析表明該方法可以特異地檢測(cè)BVDV和豬瘟病毒的RNA，該法靈敏、準(zhǔn)確、快速，可用于BVDV等瘟病毒RNA的快速檢測(cè)。通過對(duì)擴(kuò)增片段的核苷酸序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，初步確定國(guó)內(nèi)流行的BVDV主要為Ⅰ型，可分為4個(gè)不同的亞型，為國(guó)內(nèi)BVDV的防治提供了技術(shù)支持。 本試驗(yàn)建立了BVDVRT-PCR診斷方法，并證明該方法不僅可以準(zhǔn)確快速診斷BVDV，而且可以診斷BVDV同屬的豬瘟病毒。同時(shí)利用pET30a