牛病毒性腹瀉病毒套式RT-PCR分型檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用的研究.pdf

1、牛病毒性腹瀉/黏膜病(BVD/MD),簡(jiǎn)稱牛病毒性腹瀉(BVD),是由牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)感染牛引起的以發(fā)熱、黏膜糜爛潰瘍、白細(xì)胞減少、腹瀉、持續(xù)性感染與免疫耐受及懷孕母牛流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和畸形胎等為主要特征的一種傳染病。牛病毒性腹瀉病毒在世界各國(guó)普遍存在,給畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前,國(guó)內(nèi)已有20多個(gè)省、市、自治區(qū)報(bào)道存在BVDV感染。
　　 BVDV的檢測(cè)方法大體分為血清學(xué)檢測(cè)和病原學(xué)檢測(cè)兩種,以病原診斷為主,通常

2、聯(lián)合使用可獲得理想效果。本研究從病原診斷入手,利用分子生物軟件比對(duì)Genbank上已發(fā)表的BVDV全基因組序列,同時(shí)參考已發(fā)表文獻(xiàn),分別在基因組5'UTR和非結(jié)構(gòu)蛋白NS5B兩處基因相對(duì)保守區(qū),設(shè)計(jì)合成兩套套式RT-PCR引物分型檢測(cè)BVDV核酸。經(jīng)試驗(yàn)表明,兩套引物均能夠?qū)VDV分型檢測(cè)。綜合比較引物的優(yōu)勢(shì)后,選取了NS5B區(qū)的引物建立套式RT-PCR檢測(cè)方法。參考已發(fā)表文獻(xiàn),使用外源基因EGFP作為內(nèi)部參照,設(shè)計(jì)合成了一系列引物獲

3、得大小不等的EGFP片段,比較試驗(yàn)選取了適合于本實(shí)驗(yàn)的片段引入反應(yīng)體系中,并優(yōu)化反應(yīng)條件,以達(dá)到監(jiān)控RT-PCR和PCR整個(gè)反應(yīng)過程,結(jié)合陰性對(duì)照,使得檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確真實(shí)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法相比商品化試劑盒在血清樣品檢測(cè)上更靈敏,最低可檢測(cè)出10-4TCID50的病毒核酸,核酸最低檢出量為2.6pg,且相比國(guó)內(nèi)已報(bào)道的RT-PCR檢測(cè)方法更為敏感。特異性試驗(yàn)表明本方法可以將BVDV與同屬的豬瘟病毒及其他臨床癥狀相似的牛病病原體區(qū)分開。

4、應(yīng)用本方法對(duì)東北地區(qū)四個(gè)不同奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)共322份血清和132份奶液樣品進(jìn)檢測(cè),部分樣品與商品化抗原捕獲ELISA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較,符合率較低。后將陽性樣品接種長(zhǎng)滿單層的MDBK細(xì)胞,盲傳兩代后再使用RT-PCR復(fù)檢并測(cè)序,結(jié)果符合率100％。表明所建立的套式RT-PCR方法可以用于BVDV臨床檢測(cè)和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。診斷結(jié)果結(jié)果顯示所檢牛場(chǎng)存在著BVDV感染。
　　 綜上,本研究提供了一套切實(shí)可行、簡(jiǎn)便快捷且成本相對(duì)較低的牛