豬嵴病毒、豬星狀病毒和豬環(huán)曲病毒的多重RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、由病毒感染導(dǎo)致豬腹瀉的生豬肉可通過市場流通傳染給人的潛在危害逐漸引起人們的高度關(guān)注，尤其是近些年來新發(fā)現(xiàn)的，且研究還不夠完善的病毒。如今豬嵴病毒(porcine kobuvirus，PKV)、豬環(huán)曲病毒(porcine torovirus，PToV)、豬星狀病毒(porcine Astroviride，PAstV)在腹瀉豬體內(nèi)檢出率高，并且與它們同屬的其他病毒也有報(bào)道在腹瀉或腸道病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，故也增加了PKV、PToV、PAstV對(duì)感染

2、人這一潛在風(fēng)險(xiǎn)的研究價(jià)值。但是這三種病毒的流行病學(xué)和臨床癥狀極為相似，在臨床和病理學(xué)上很難區(qū)分。為了進(jìn)一步研究這三種可能致豬腹瀉的病毒，本研究建立了能同時(shí)檢測這三種病毒的多重RT-PCR檢測方法，并對(duì)四川某屠宰場的豬肉和豬的腸道內(nèi)容物進(jìn)行采樣和初步檢測試驗(yàn)。其主要結(jié)果如下:
　　1.PKV、PAstV和PToV的多重RT-PCR檢測方法的建立
　　根據(jù)GenBank登錄的PKV3D基因、PAstV ORE2基因、PToVM基

3、因，利用軟件Primer5.0分別設(shè)計(jì)了三對(duì)特異性引物。預(yù)計(jì)擴(kuò)增大小分別為358bp、938bp和718bp的片段。先分別建立了針對(duì)各病毒的單項(xiàng)RT-PCR檢測方法，在此基礎(chǔ)上，經(jīng)過反應(yīng)條件和反應(yīng)程序的優(yōu)化，建立了一種能夠同時(shí)檢測PKV、PAstV和PToV的多重RT-PCR的方法，能從PKV、PAstV和PToV的陽性模板中同時(shí)擴(kuò)增出與目的片段大小相符的3條特異性條帶;并將多重RT-PCR和單項(xiàng)RT-PCR方法進(jìn)行了比較。敏感性試驗(yàn)中

4、，多重RT-PCR檢測方法能夠檢測到PKV、PAstV和PToV的最低濃度分別約為1.51×104拷貝/μL、1.19×103拷貝/μL、1.26×104拷貝/μL;對(duì)同一模板進(jìn)行了五次檢測，與單項(xiàng)RT-PCR結(jié)果一致。結(jié)果表明，本方法具有很好的特異性、敏感性和重復(fù)性;同時(shí)具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可用于PKV、PAstV和PToV的檢測。
　　2.多重RT-PCR檢測方法的初步應(yīng)用
　　用多重RT-PCR檢測方法對(duì)屠宰場隨機(jī)采

5、取20頭豬的豬肉進(jìn)行PKV、PAstV、PToV檢測，結(jié)果顯示20份豬肉均未檢出;對(duì)四川部分地區(qū)豬場的96份屠宰生豬的腸內(nèi)容物進(jìn)行采樣，運(yùn)用建立的多重RT-PCR方法對(duì)其進(jìn)行檢測，結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)PKV、PAstV、PToV的陽性檢出率分別為47％、15％，11％，不同交叉混合感染的有23份，其中12份檢出PKV和PAstV混合感染，5份PKV和PToV混合感染，4份PAstV和PToV混合感染，2份樣品同時(shí)檢測出三種病毒感染。該方法的