牛病毒性腹瀉病毒單克隆抗體的制備與雙抗夾心ELISA方法的建立.pdf

1、牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea,BVD)又稱為粘膜病(Mucosal disease，MD)，是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起，臨床癥狀主要為精神沉郁、流涎、產(chǎn)奶量下降甚至停奶、腹瀉和結(jié)膜炎等，孕牛出現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)出畸形胎兒或產(chǎn)出持續(xù)感染(PI)牛，新生犢牛因嚴(yán)重腹瀉而死亡。PI牛一生持續(xù)帶毒并不斷持續(xù)向外界排毒，是BVDV最主要的傳染源。牛病毒性腹瀉流行

2、范圍廣，給全球養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的損失。
　　BVDV的E0蛋白是最保守的結(jié)構(gòu)蛋白之一，能被分泌到細(xì)胞外，樣品不用做任何處理就能用抗原捕獲ELISA(ACE-ELISA)檢測(cè)，具有重要的診斷價(jià)值;E2是BVDV的主要保護(hù)性抗原;p80蛋白結(jié)構(gòu)保守，針對(duì)p80的單抗能區(qū)分出動(dòng)物是疫苗免疫還是自然感染的，可以用于鑒別診斷，有利于BVDV的凈化。目前國(guó)外開發(fā)的抗原捕獲ELISA(ACE)具有良好的敏感性、特異性和可重復(fù)性，可以用于檢測(cè)BV

3、DV的抗原，是一種操作簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)的可以檢測(cè)PI牛的方法。目前我國(guó)尚缺乏可用的特異性良好的針對(duì)BVDV的p80、E0及E2蛋白的單克隆抗體，亦無(wú)自主研發(fā)的檢測(cè)BVDV抗原的試劑盒，因此急需開展相關(guān)的研究。
　　本研究利用MDBK細(xì)胞大量培養(yǎng)BVDV致細(xì)胞病變型毒株VEDEVAC和非致細(xì)胞病變型毒株3877，通過(guò)PEG濃縮和蔗糖密度梯度離心法純化病毒作為免疫原，免疫Balb/c小鼠，通過(guò)間接ELISA和間接免疫熒光(IFA)進(jìn)行陽(yáng)性雜

4、交瘤細(xì)胞的篩選。經(jīng)過(guò)3次亞克隆后，獲得7株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1E3、2C3、3F5、1B7、2B10、3E10、1B12。IFA結(jié)果表明這7株雜交瘤細(xì)胞分泌的單抗具有良好的特異性。免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果表明其中4株單抗(2B10、1B7、3F5與3E10)為構(gòu)象型表位，其余3株(1E3、2C3、1B12)為線性表位。間接免疫熒光(IFA)結(jié)果表明3E10是針對(duì)E2蛋白的單抗，3F5是針對(duì)P80蛋白的單抗。
　

5、　同時(shí)利用制備的單克隆抗體3E10和3F5作為捕獲抗體，將辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的1B12作為檢測(cè)抗體，初步建立了雙抗夾心ELISA。特異性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明該法不與MDBK細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)，亦不與牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)等其它牛呼吸道疾病病原反應(yīng)，只針對(duì)BVDV。
　　綜上所述，本研究成功制備了7株BVDV單抗，其中4株單克隆抗體(2B10、1B7、3F5與3E10)針對(duì)的抗原表位為構(gòu)象型表