牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）抗原捕獲ELISA檢測試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化研究.pdf

1、本文通過MDBK細(xì)胞增殖BVDV，收獲病毒細(xì)胞培養(yǎng)物，利用PEG法和蔗糖密度梯度離心法，濃縮、純化病毒，得到純度較高的病毒。用純化BVDV接種家兔的方法擴增病毒，結(jié)果表明，家兔接毒后，不產(chǎn)生定型熱，且病毒毒力減弱。 用純化BVDV分別免疫家兔和蛋雞，制備出瓊擴效價為1：32以上的兔抗BVDV高免血清與ELISA效價為1：6400的抗BVDV卵黃抗體，并分別得出這兩種抗體消長的規(guī)律。復(fù)蘇本實驗室研制并保存的8株分泌抗BVDV單抗隆

2、抗體雜交瘤細(xì)胞株，按常規(guī)方法制備單抗腹水。經(jīng)間接ELISA檢測，結(jié)果除一株(5F11)雜交瘤細(xì)胞株抗體滴度下降明顯外，其余7株無明顯變化，均能穩(wěn)定分泌抗體。 通過對抗原捕獲ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定了各組分的最佳工作條件，并在此基礎(chǔ)上組裝成兩套檢測試劑盒。通過試驗確定，BBI公司生產(chǎn)的酶標(biāo)板(變異系數(shù)為4.3％)為試劑盒所用酶標(biāo)板；兔抗BVDV高免血清、抗BVDV卵黃抗體最佳包被濃度分別為1：1000和1：50；待測血清樣品

3、稀釋濃度為1：20；McAb最適稀釋濃度為1：10，HRP-羊抗鼠IgG工作濃度為1：800。組裝成了兩套試劑盒，經(jīng)試驗，兩套檢測試劑盒的檢測靈敏度均達(dá)到274ng/mL，其敏感性是AGP的100倍，與AGP陽性符合率是100％；與冠狀病毒及輪狀病毒無交叉反應(yīng)，但與豬瘟病毒存在交叉反應(yīng)；通過引入質(zhì)控血清進(jìn)行質(zhì)控檢驗，兩種檢測試劑盒所得檢測結(jié)果均在質(zhì)量控制范圍內(nèi)，達(dá)到預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)化要求。經(jīng)穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗，試劑盒①批間和批內(nèi)的變異系數(shù)分別為