牛病毒性腹瀉病毒重組E2蛋白多克隆抗體制備及間接ELISA方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、牛病毒性腹瀉/粘膜病（Bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD）由牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）引起，可引起牛群臨床和病理學(xué)癥狀，表現(xiàn)為繁殖障礙、胎兒畸形及廣泛的免疫抑制，導(dǎo)致牛群生產(chǎn)力低下和嚴(yán)重的粘膜病，從而造成世界范圍養(yǎng)牛業(yè)的重大損失。牛病毒性腹瀉病毒基因組編碼11種蛋白，其中E2蛋白是病毒主要的保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，保護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不受同源毒株的攻擊。利用已有的表達(dá)BVDVE2

2、蛋白的重組質(zhì)粒pET30a-E2轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21（DE3），經(jīng)培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)出重組E2蛋白，Westernblot顯示純化的重組E2蛋白能夠與BVDV陽性血清反應(yīng)。用純化的重組E2蛋白免疫新西蘭白兔制備了多克隆抗體，病毒中和試驗(yàn)測定其中和抗體效價(jià)為1:2048。間接免疫熒光和免疫印跡試驗(yàn)證實(shí)了其具有良好的反應(yīng)性。間接免疫熒光試驗(yàn)證明其在1:1280倍稀釋時(shí)仍具有較高的活性。本研究所制備的BVDV重組E2蛋白兔源多克隆抗體可應(yīng)用于國內(nèi)BV

3、DV的檢測，同時(shí)為進(jìn)一步建立檢測BVDVE2蛋白的ELISA奠定了基礎(chǔ)。
　　 將純化后的BVDVE2蛋白作為包被抗原建立了檢測牛病毒性腹瀉病毒抗體的間接ELISA，將其命名為E2-ELISA。通過一系列試驗(yàn)，確定了重組抗原最佳包被濃度（12.8μg/ml）；最佳封閉液（1％明膠）和最佳封閉時(shí)間（60min）；血清樣本最佳稀釋度（1:160）和最佳作用時(shí)間（60min）；酶標(biāo)二抗最佳工作濃度（1:5000）和最佳作用時(shí)間（60m

4、in）；底物最佳顯色時(shí)間（10min）；判定臨界值（OD>10.364者判為陽性，OD<0.364者判為陰性）。交叉反應(yīng)試驗(yàn)表明，該重組抗原與其它常見6種牛病的陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。阻斷試驗(yàn)表明，BVDV細(xì)胞培養(yǎng)液能在很大程度上阻斷重組抗原與陽性血清的反應(yīng)，而對陰性血清沒有明顯的影響。重復(fù)性試驗(yàn)表明，批內(nèi)重復(fù)的變異系數(shù)小于10％，批間重復(fù)的變異系數(shù)小于10％。與病毒中和試驗(yàn)相比，符合率、特異性和敏感性分別為86.3％、82.6％和87

5、.7％。與瑞典進(jìn)口全病毒ELISA診斷試劑盒相比，符合率、特異性和敏感性分別為87.5％、85％和88.3％。應(yīng)用BVDVE2-ELISA檢測了黑龍江省內(nèi)的852份牛血清樣本，其抗體陽性率為74.18％（632/852）。上述結(jié)果表明，BVDVE2-ELISA診斷方法具有較好的敏感性和特異性，顯示出了良好的應(yīng)用前景。
　　 本研究成功表達(dá)了BVDVE2基因，獲得了以包涵體形式表達(dá)的重組E2蛋白，制備了具有高病毒中和活性和特異性的