牛病毒性腹瀉病毒調(diào)節(jié)牛外周血單核細(xì)胞IFN、Th1-Th2細(xì)胞因子和TLR mRNA轉(zhuǎn)錄的研究.pdf

1、牛病毒性腹瀉（Bovine viral diarrhea，BVD）是由牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）引起的，主要侵害牛、羊、鹿、牦牛等反芻動(dòng)物及豬的一種重要傳染病。牛病毒性腹瀉病毒屬于黃病毒科 (Flaviviridae) 瘟病毒屬（Pestivirus）。牛病毒性腹瀉病毒感染動(dòng)物機(jī)體后，可以使動(dòng)物的生殖、呼吸、循環(huán)、免疫、淋巴細(xì)胞、肌肉與骨骼系統(tǒng)、皮膚、中樞神經(jīng)等諸多系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)的病理變化；同時(shí)導(dǎo)致動(dòng)物繁殖率下降，給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)

2、損失。對(duì)于本病國(guó)內(nèi)外尚無(wú)可靠有效的商品化疫苗，所以盡快搞清楚本病的致病機(jī)理，對(duì)于研制出更加安全可靠有效的疫苗、控制本病發(fā)生和蔓延就顯得尤為重要。本試驗(yàn)擬通過研究不同生物型BVDV感染體外培養(yǎng)的牛外周血單核細(xì)胞后干擾素、Th1/Th2 型細(xì)胞因子、Toll 樣受體 mRNA的轉(zhuǎn)錄情況，以達(dá)到了解病毒感染后動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞后免疫功能狀態(tài)，為進(jìn)一步探討 BVDV 感染動(dòng)物的發(fā)病機(jī)理和持續(xù)感染的分子調(diào)節(jié)機(jī)制提供參考。
　　 本試驗(yàn)建立了檢測(cè)

3、牛IFN、Th1/Th2細(xì)胞因子和 TLR基因的SYBR-Green 1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法。根據(jù) GenBank 上牛 IFN (BoIFN-α、-β、-γ)、Th1/Th2 (BoIL-2,4,6,8、TNF-α)和 TLR (BoTLR-3,4,7,8)基因的序列，在保守區(qū)設(shè)計(jì)并合成各自特異引物，并以牛3-磷酸甘油脫氫酶 (GAPDH)基因?yàn)閮?nèi)參，采用 SYBR Green I 染料以建立實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)方法。將

4、 IFN、Th1/Th2細(xì)胞因子和 TLR基因克隆測(cè)序，將所得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，作為標(biāo)準(zhǔn)品模板建立 SYBR-Green 1 熒光定量 PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線并做溶解曲線分析，并做靈敏性、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果表明，牛IFN、Th1/Th2細(xì)胞因子、TLR和 GAPDH基因的Ct 值與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度在 1×101～1×109 copies/μL 范圍分別呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于 0.991。熔解曲線分析表明，產(chǎn)物為特異的單峰，特異性和重復(fù)

5、性較好，為在 mRNA 水平對(duì)牛 IFN、Th1/Th2細(xì)胞因子和 TLR基因的定量分析奠定了基礎(chǔ)。
　　 應(yīng)用上述建立的細(xì)胞因子檢測(cè)方法，我們測(cè)定了非致細(xì)胞病變型（noncytopathic，NCP）型和致細(xì)胞病變型（cytopathic，CP）型 BVDV 感染外周血單核細(xì)胞后IFN、Th1/Th2細(xì)胞因子、促炎性細(xì)胞因子和TLR mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明：在NCP型BVDV 感染前期IFN-γ、TNF-α、IL-2、T

6、LR-4和TLR-8 呈現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，在CP型BVDV 感染前期TNFα、IL-4、IL-6、TLR-4和TLR-8 呈現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)；在NCP型 BVDV感染后期IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、TLR-3、TLR-4、TLR-7和TLR-8 呈現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，在CP 型 BVDV感染后期IFN-α、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-8、TLR-4和TLR-8 呈現(xiàn)出明顯的上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)；總而言之，N