牛病毒性腹瀉與粘膜病

1、牛病毒性腹瀉與黏膜病,,牛病毒性腹瀉，又稱牛病毒性腹瀉/粘膜病，是由BVDV引起的，主要侵害牛、羊、鹿、牦牛等反芻動(dòng)物及豬的一種重要傳染病。臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、粘膜糜爛、潰瘍、白細(xì)胞減少、持續(xù)感染、咳嗽及懷孕母牛流產(chǎn)或產(chǎn)生畸形胎兒。同一種病原引起的多種病狀的傳染病 我國(guó)1980年李佑民首從國(guó)外進(jìn)口奶牛分離出BVDV；上世紀(jì)90年代鄭志剛等在全國(guó)范圍內(nèi)調(diào)查，BVDV平均陽(yáng)性率為19.56%，近年來(lái)本病在國(guó)內(nèi)陽(yáng)性檢出率呈逐年上

2、漲的趨勢(shì)。本病給養(yǎng)牛業(yè)造成明顯損失（產(chǎn)乳↓、重↓、流產(chǎn)等）。,牛病毒性腹瀉,BVDV的流行病學(xué),BVDV的病原學(xué),BVDV的基因結(jié)構(gòu)及其蛋白,BVDV的研究進(jìn)展,內(nèi)容摘要,BVDV的防治,BVDV的主要診斷方法,BVDV的流行病學(xué),傳 染 源：病牛和帶毒牛是主要傳染源。傳播途徑：主要通過(guò)消化道和呼吸道傳播；直接或間接接觸也可以傳播；吸血昆蟲(chóng)也是重要的傳播媒介。易感動(dòng)物：主要感染牛（肉牛、奶牛），也可感染豬。 本病多發(fā)于

3、寒冷季節(jié)，過(guò)分擁擠可促進(jìn)本病發(fā)生。,BVDV的病原學(xué),屬黃病毒科、瘟病毒屬有囊膜，直徑25-30nm，正鏈RNA胎牛腎、睪丸、豬腎、胎羊睪丸可增殖傳代 BVDV。BVDV 可以分成致細(xì)胞病變型（CP）和非致細(xì)胞病變型（NCP）。,,BVDV的基因結(jié)構(gòu)及其蛋白,5'-Npro（P20）-C(P14)-Erns(gp48)-E1 (gp25)-E2(gp53)-P7- NS2-3 (P125)-NS4A (P10)- NS4B

4、(P30)- NS5A (P58)- NS5B (P75)-3',其中C，ERNS，E1，E2是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。其余為非結(jié)構(gòu)蛋白。,BVDV的主要基因、蛋白研究進(jìn)展,,,,,,,,,,,,,核衣殼組成成分，具有免疫原性,BVDV 基因組具有較高的保守性,瘟病毒屬內(nèi)高度保守，在病毒復(fù)制、病毒RNA轉(zhuǎn)譯或者病毒多聚蛋白加工過(guò)程中具有重要作用,5‘-UTR,C,NS3,ERNS,內(nèi)有一高度保守結(jié)構(gòu)域，可用于研究亞單位疫苗，也可作為基因

5、工程診斷抗原,E2,與抗BVDV抗體結(jié)合、介導(dǎo)免疫中和反應(yīng)及與宿主細(xì)胞識(shí)別、吸附的主要部位,Npro,具有自體蛋白酶活性，有較高的保守，可以對(duì)瘟病毒進(jìn)行種、群或型的鑒定,5'-UTR：5'末端無(wú)甲基化的“帽子”結(jié)構(gòu)，5'-UTR序列在BVDV的各毒株間有較高的保守性，因此常根據(jù)5'-UTR的序列設(shè)計(jì)引物來(lái)檢測(cè) BVDV或?qū)?BVDV 進(jìn)行分型。5'-UTR 在病毒轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程中起重要的作用。2

6、010年張興娟等分別用5'-UTR設(shè)計(jì)一對(duì)引物，預(yù)擴(kuò)增片段125bp；2010年孟雨等人也利用5'-UTR設(shè)計(jì)一對(duì)引物，預(yù)擴(kuò)增片段218bp，實(shí)驗(yàn)證明利用5'-UTR設(shè)計(jì)引物具有很好的特異性和敏感性。,E2：是BVDV的主要保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，所以新型疫苗都是針對(duì)E2結(jié)構(gòu)蛋白的。也是與抗 BVDV 抗體結(jié)合、介導(dǎo)免疫中和反應(yīng)及與宿主細(xì)胞識(shí)別、吸附的主要部位，E2 基因一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究瘟病毒的重

7、點(diǎn)。E2 是形成 BVD 基因工程疫苗的最好的選擇。BVDV E2 DNA 疫苗是近年來(lái) BVDV 免疫研究的熱點(diǎn)。如2007吳明福等構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-E2 并免疫小鼠，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定程度的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。,,NS-3：NS3區(qū)域與病毒的毒力，生長(zhǎng)特性有關(guān)。NS3在瘟病毒屬內(nèi)高度保守，在病毒復(fù)制、病毒RNA轉(zhuǎn)譯或者病毒多聚蛋白加工過(guò)程中具有重要作用。NS3的表達(dá)與宿主細(xì)胞CPE的產(chǎn)生有密切關(guān)系。20

8、09年魏偉等用BVDV NS3 蛋白中有免疫反應(yīng)性的重組片段作為包被抗原，建立了一個(gè) BVDV 抗體檢測(cè)的間接 ELISA 方法。,,血清學(xué)診斷,免疫學(xué)診斷,診斷方法的進(jìn)展,分子生物學(xué)診斷,1,2,3,血清學(xué)診斷,常見(jiàn)的方法為主要包括血清中和試驗(yàn)和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)兩種。 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)準(zhǔn)確性較低，檢出的結(jié)果常常有假陽(yáng)性。 血清中和試驗(yàn)重復(fù)性高，準(zhǔn)確性好，已作為 BVDV 診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但血清中和試驗(yàn)在基層使用時(shí)，常遇

9、到費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，需要細(xì)胞培養(yǎng)等試驗(yàn)室技術(shù)問(wèn)題，無(wú)法得到推廣。,免疫學(xué)診斷,,免疫熒光技術(shù)（IFA）,免疫過(guò)氧化物酶技術(shù)（IP）,,,,,免疫熒光技術(shù)（IFA）,,免疫熒光技術(shù)（IFA）又稱熒光抗體技術(shù)，可用于檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物以及病變組織的冰凍切片中 BVDV 感染情況。 免疫熒光抗體技術(shù)特異、敏感、快速，但它需要熒光顯微鏡，使得此技術(shù)無(wú)法得到推廣應(yīng)用。,,,ELISA,ELISA 常被用于檢測(cè)組織器官培養(yǎng)物中 BVDV，監(jiān)測(cè)牛群中

10、 BVD 抗體水平，評(píng)估潛伏感染情況。其中最常用的是雙抗夾心 ELISA 和間接 ELISA，也有使用 BVDV 單克隆抗體與 ELISA 聯(lián)合診斷 BVD。 研究較多的IBRV診斷蛋白有NS3，E2蛋白,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,免疫過(guò)氧化物酶技術(shù)（IP）診斷 BVDV 準(zhǔn)確、可靠，可用于了解 BVD 的總體分布情況。鏈酶親和素-生物素過(guò)氧化物酶檢測(cè)方法，可以用來(lái)檢測(cè)福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片中的BVDV。,近年來(lái)，

11、為了避免非特異性染色反應(yīng)，則可以使用單克隆抗體+生物素化抗鼠抗體-鏈酶親和素過(guò)氧化物酶檢測(cè)方法。,免疫過(guò)氧化物酶技術(shù)（IP）,,,分子生物學(xué)診斷,,,,,,RT-PCR,核酸探針檢測(cè),1,2,,,,,,,,,,,,RT-PCR,RT–PCR 是目前廣泛應(yīng)用的分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)于檢測(cè) BVDV 的 RNA 是一個(gè)合適的方法。根據(jù) BVDV 基因組序列合成一對(duì)或幾對(duì)特異性引物，可以高度特異、敏感的檢測(cè)出器官、組織、細(xì)胞培養(yǎng)物中的 BVDV，

12、并可區(qū)別 CSFV、BDV，還可對(duì) BVDV 的基因型和生物型作進(jìn)一步的鑒定,,PCR引物多數(shù)選在BVDV保守區(qū)5’-UTR和NS3基因內(nèi)，尤其5’UTR是BVDV進(jìn)行鑒定、基因分型的首選區(qū)域。 2007年王偉利建立了 BVDV 熒光 RT-PCR 檢測(cè)方法并進(jìn)行了初步應(yīng)用，2007年國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫局制定了牛病毒性腹瀉/黏膜病反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)操作規(guī)程,,核酸探針檢測(cè)（NAH）,與傳統(tǒng)方法相比，該技術(shù)敏感，特異性強(qiáng)，而

13、且應(yīng)用很廣泛，NAH 可直接檢測(cè)臟器組織和血細(xì)胞中的 BVDV。NAH 技術(shù)應(yīng)用最廣泛的是核酸標(biāo)記法，按核酸探針標(biāo)記物不同可分為兩類：一類是放射性同位素（如 32P，35S）標(biāo)記的 DNA 探針，另一類是用如地高辛、生物素標(biāo)記的 DNA 探針。核酸探針技術(shù)標(biāo)記簡(jiǎn)單，特異性好，可長(zhǎng)期保存，并且可以回收利用，制成試劑盒，是一種安全、快速、經(jīng)濟(jì)的診斷方法。,,預(yù)防和控制,免疫預(yù)防和藥物治療健全完善 BVD 檢測(cè)體系，加強(qiáng)檢測(cè)牛群及牛源生物制