牛病毒性腹瀉病毒囊膜蛋白Erns-E2的原核表達(dá)及噬菌體展示anti-BVDV納米抗體文庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、牛病毒性腹瀉/粘膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease)是由牛病毒性腹瀉病毒引起的、主要發(fā)生于牛的一種急性、熱性傳染病,其臨診特征為黏膜發(fā)炎、糜爛、壞死和腹瀉。本病呈世界性分布,廣泛存在于歐美等許多養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家。自1980年以來我國(guó)從國(guó)外引進(jìn)奶牛和種牛,將本病傳入我國(guó),并對(duì)病毒進(jìn)行了分離鑒定。發(fā)達(dá)國(guó)家針對(duì)感染牛群多采取大量淘汰或屠殺,目前尚無有效的疫苗對(duì)BVDV進(jìn)行預(yù)防,給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大

2、的經(jīng)濟(jì)損失,促使人們不斷尋求新的防治BVDV的途徑,以便更好的控制該病的發(fā)生和流行。
　　自雜交瘤細(xì)胞技術(shù)問世,單克隆抗體已被廣泛用于疾病的診斷和治療?？贵w來自于有機(jī)體,使用過程中無毒性,在人們看來抗體用于治療疾病似乎具有無限的潛力。然而傳統(tǒng)的單克隆抗體依然存在各種缺陷,比如:體積大、穩(wěn)定性差、制備工藝繁瑣、耗資高、必須人源化等。駝科動(dòng)物和鯊魚體內(nèi)存在一種特殊的天然缺失輕鏈的重鏈抗體。這種重鏈抗體的可變區(qū)序列具有體積小、容易獲得、

3、高水溶性和穩(wěn)定性、能夠識(shí)別溝槽或縫隙間的抗原表位及結(jié)合活性好等優(yōu)點(diǎn),被稱作是單域抗體,又稱納米抗體。鑒于單域抗體的這些優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于臨床診斷和治療。
　　本項(xiàng)研究根據(jù)GenBank公布的BVDV-NADL株Erns(E0)、E2基因的核苷酸序列,設(shè)計(jì)引物,采用PCR技術(shù)從pACNR/NADL質(zhì)粒中擴(kuò)增Erns、E2基因,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Erns、pET-32a-E2,將其轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21中,經(jīng)IPTG

4、誘導(dǎo),用SDS-PAGE及Western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況及其反應(yīng)原性。將牛病毒性腹瀉病毒接種長(zhǎng)滿單層的MDBK細(xì)胞,接種72h后,收取病毒液。將全病毒滅活,免疫雙峰駝。分離外周血淋巴細(xì)胞,并提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用巢式PCR技術(shù)擴(kuò)增重鏈抗體可變區(qū)基因的核苷酸序列,構(gòu)建噬菌體展示載體,經(jīng)過多次連接轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建初始文庫(kù)。利用M13KO7輔助性噬菌體超感染構(gòu)建噬菌體展示anti-BVDV納米抗體文庫(kù)。

5、
　　本試驗(yàn)成功構(gòu)建牛病毒性腹瀉病毒囊膜蛋白Erns、E2的原核表達(dá)載體,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白分別為45KD、64KD左右,經(jīng)Ni-NTA蛋白純化儀純化蛋白,獲得純度較高的蛋白。Western blot試驗(yàn)表明目的蛋白具有很好的反應(yīng)原性。以cDNA為模板,擴(kuò)增駝源重鏈抗體可變區(qū)序列,構(gòu)建庫(kù)容量為4.32×105初始文庫(kù)。輔助噬菌體救援后,獲得噬菌體展示納米抗體文庫(kù),滴度達(dá)1.3×1011。為后續(xù)利用BVDV的囊膜蛋白Erns、E2作