牛病毒性腹瀉病毒陜西株的分離與NS-,5B-基因序列測定.pdf

1、牛病毒性腹瀉-黏膜病(Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD)是由牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的一種以發(fā)熱、腸粘膜糜爛潰瘍、白細(xì)胞減少、腹瀉、咳嗽、持續(xù)性感染與免疫耐受及懷孕母牛流產(chǎn)或產(chǎn)出畸形胎兒為主要特征的，復(fù)雜的，呈多種臨床類型的傳染病，對養(yǎng)牛業(yè)危害非常大，是世界各國重點(diǎn)防制和檢疫的對象。BVD-MD主要感染牛、羊、

2、鹿、豬等。此病的分布幾乎遍布全世界，我國自1980年首次報道該病以來，已有20多個省份相繼報道有本病的發(fā)生。1994年陳茂盛等對陜西省13個縣的肉牛、奶牛BVDV的感染情況做了血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性率為12.7％。近年來該病在陜西牛群中的流行有擴(kuò)大的趨勢，但至今未見BVDV陜西分離株的相關(guān)研究報道。2007年陜西某規(guī)模化奶牛場多頭犢牛發(fā)生頑固性腹瀉，疑為BVDV或輪狀病毒(Rotavirus，RV)感染所致，筆者隨即采集病死犢牛的腸系

3、淋巴結(jié)，對病原進(jìn)行了分離鑒定。參考NS5B基因保守序列設(shè)計1對引物：P1:5'-TGG AGA TCT TTC ACA CAA TAG C-3'：P2:5’-GCT GTT TCA CCC AGT TATACA T-3'，用于BVDV NS5b基因的擴(kuò)增；另外參照RV的VP1基因保守序列設(shè)計1對引物，P3:5'-AGAATTTCC GTT TGG CTA-3'；P4:5’-CGGTCACATCATACAACT CT-3'，用于RV VP

4、1基因擴(kuò)增。取發(fā)病犢牛的腸系淋巴結(jié)，進(jìn)行研磨處理后，取上清液，按Invitrogen公司的TRIZOL LS@ Reagent試劑盒操作說明書提取病毒基因組RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果擴(kuò)增到約360bp的BVDVNS5B基因，未擴(kuò)增到RVVP1基因，初步鑒定為牛病毒性腹瀉-黏膜病。取病料上清液接種于MDBK細(xì)胞，盲傳4代后出現(xiàn)典型、規(guī)律的細(xì)胞病變。采用病毒蝕斑技術(shù)對病毒進(jìn)行克隆純化，提取其基因組RNA，再次進(jìn)行RT-PCR鑒定。用

5、Gel Extraction Mini Kit W5212純化回收RT-PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增的NS5B基因片段與pMD18-T載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，采用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，并對質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定(EcoR I和Sal I雙酶切及Sal I單酶切)和PCR鑒定。將陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司和上海捷瑞生物工程有限公司分別測序后進(jìn)行序列分析。結(jié)果顯示，分離毒株為致細(xì)胞病變型(CP型)BVDV，與