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文檔簡介
1、目的:
腸道病毒71型(Enterovirus71)是引起手足口病(HFMD)的重要病原,大都是幼兒感染,引起發(fā)熱,典型癥狀是在手心、腳心、口腔以及臀部出現(xiàn)多個水泡潰瘍。還會引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,會導致嚴重的并發(fā)癥和后遺癥,甚至死亡。
EV71經(jīng)典的診斷方法“金標準”是病毒培養(yǎng)分離。但是這種方法需要幾個星期的時間,而且會由于病毒滴度低或者抗原漂移而阻礙。分子生物學方法如P
2、CR技術,以用于特異性的檢測EV71核酸,而且被證實比病毒分離方法更靈敏。最近,熒光PCR實驗室病毒的鑒定上已得到廣泛認可,因為它高靈敏性特異性,能快速檢測。通過熒光的發(fā)射在擴增反應過程中的實現(xiàn)了實時檢測。
隨著EV71致的手足口病引起越來越多的關注,迫切需要一種快速而特異的方法檢測出EV71,并能與其它腸道病毒鑒別,比如CA16,??刹《镜?。本文建立一種熒光RT-PCR技術,快速、敏感的從臨床標本中檢測EV71的DNA。
3、
方法:
根據(jù)GeneBank發(fā)表的EV71全基因組序列,設計特異的引物與探針;用RT-PCR擴增出226bp的片段,通過純化后,轉(zhuǎn)化入PGM-T載體中(TA克隆),構建了重組質(zhì)粒。PCR鑒定DNA測序證實構建質(zhì)粒成功。以構建的重組質(zhì)粒為模板,優(yōu)化最佳反應條件和反應體系,建立最優(yōu)化的實時定量PCR方法。評價其靈敏性、特異性和可靠性,并用于檢測臨床標本,同時與傳統(tǒng)RT-PCR和病毒分離檢測方法比較評價其應用價值
4、。
結果:
1.經(jīng)TA克隆成功地構建了重組質(zhì)粒。
2.以重組質(zhì)粒為模板,確定定量RT-PCR反應體系如下:RT-PCR Buffer10μl;EX Taq-HS0.2μl;RT Enzyme Mix2.0μl;引物0.8μl;探針0.4μl;模板RNA2.0μl總體積為20μl。反應條件:42℃5 min;95℃10sec;95℃5sec,60℃30sec;40cycles;60℃10 min。
5、
3.方法學的評價結果:繪制了以模板拷貝數(shù)為分析指標的定量標準曲線,相關方程為Y=-3.370X+49.790,r值為0.994,線性范圍較寬(102~108copies/μl)。敏感性:54份經(jīng)測序鑒定后,確定為EV71的標本,用構建的熒光RT-PCR法方法檢測均為陽性。本方法絕對檢測低限(即能被檢測到的模板起始拷貝最低數(shù))為103拷貝/μl,傳統(tǒng)的RT-PCR檢測方法絕對檢測低限為104拷貝/μl,提高了100倍。特異
6、性檢測結果:CA16、??刹《尽⑤啝畈《?、乙腦病毒等無特異性擴增。可靠性:不同時間檢測同一份標本的變異系數(shù)小于11%。
4.對臨床標本進行檢測,熒光RT-PCR法的檢測EV71的陽性率是61.2%。病毒分離法和普通RT-PCR法檢測的陽性率分別是是16.4%、52.4%。
結論:
本研究建立的腸道病毒EV71-TaqMan熒光定量PCR方法,具有特異、靈敏、快速的特點,適用于由EV71感染引起的
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