CpG-ODN對(duì)鼠巨噬細(xì)胞TLR-9及Th1-Th2類(lèi)細(xì)胞因子分泌的影響.pdf

1、背景：支氣管哮喘是由淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子共同參與的一種氣道慢性炎癥。免疫反應(yīng)在哮喘的發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。目前有人研究發(fā)現(xiàn)哮喘的發(fā)病的重要基礎(chǔ)是輔助性T細(xì)胞兩種亞型Th1和Th2細(xì)胞組成的比例和功能失衡。肺泡巨噬細(xì)胞可通過(guò)吞噬凋亡的嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等而有利于哮喘氣道炎癥的消退，同時(shí)也可通過(guò)釋放多種細(xì)胞因子和蛋白酶，參與哮喘免疫炎癥反應(yīng)及氣道的修復(fù)和重構(gòu)，為支氣管哮喘的重要效應(yīng)細(xì)胞之

2、一。因此，研究巨噬細(xì)胞在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用，調(diào)控巨噬細(xì)胞功能可能為支氣管哮喘治療提供一個(gè)新思路。 CpG-ODN是含未甲基化的CpG二核苷酸的寡核苷酸序列，和細(xì)菌DNA一樣具有強(qiáng)烈的免疫刺激作用，能激活哺乳動(dòng)物巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞。CpG-ODN還能誘導(dǎo)Th1細(xì)胞因子產(chǎn)生，抑制Th2細(xì)胞因子的釋放，誘導(dǎo)Th1反應(yīng)，下調(diào)Th2反應(yīng)，并使Th2反應(yīng)向Th1反應(yīng)轉(zhuǎn)變，使Th1/Th2免疫反應(yīng)達(dá)到平衡的狀態(tài)。而調(diào)節(jié)

3、Th1/Th2平衡對(duì)哮喘的治療具有重要意義。其激活效應(yīng)細(xì)胞途徑是通過(guò)Toll樣受體9 (Toll like-receptor，TLR-9) 介導(dǎo)的。TLR-9在識(shí)別CpG-ODN后，通過(guò)結(jié)構(gòu)域募集髓樣分化因子(Myeloid differentiation factor88，MyD88)，核因子K B等多條信號(hào)途徑，啟動(dòng)細(xì)胞活化進(jìn)程，上調(diào)主要組織相容性復(fù)合物和共刺激分子表達(dá)等，進(jìn)而誘導(dǎo)各種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。因此研究CpG-ODN與TL

4、R-9相互識(shí)別后對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌，TLR-9自身表達(dá)的影響，對(duì)于揭開(kāi)CpG-ODN調(diào)控巨噬細(xì)胞功能的分子機(jī)制具有重要意義。 目的： (1) 從mRNA 和蛋白水平分析CpG-ODN 刺激鼠巨噬細(xì)胞后對(duì)鼠巨噬細(xì)胞TLR-9的表達(dá)。探討CpG-ODN調(diào)控巨噬細(xì)胞TLR-9表達(dá)的特征。 (2) 檢測(cè)CpG-ODN刺激前后巨噬細(xì)胞上清液中Th1類(lèi)細(xì)胞因子TNF-a、IL-12及Th2類(lèi)細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)水平，

5、了解CpG-ODN刺激鼠巨噬細(xì)胞后對(duì)Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞因子分泌的影響。探討CpG-ODN調(diào)控巨噬細(xì)胞功能及TLR-9表達(dá)的分子機(jī)制。 方法： (1) 本研究采用體外培養(yǎng)小鼠單核-巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞，分別用CpG-ODN，Non-CpG-ODN，CpG-ODN +氯喹和培養(yǎng)基刺激巨噬細(xì)胞24小時(shí)，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)并比較各組細(xì)胞TLR-9mRNA的表達(dá)情況，同時(shí)用免疫印跡法(Weste

6、rn blotting)進(jìn)一步驗(yàn)證TLR-9蛋白的表達(dá)。 (2) 放免法檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞上清液中TNF-a、IL-6的表達(dá)水平。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞上清液中IL-12的表達(dá)水平。 結(jié)果： (1) 刺激24小時(shí)后，CpG-ODN與CpG-ODN +氯喹組巨噬細(xì)胞上清中TLR-9mRNA的表達(dá)均顯著高于Non-CpG-ODN及對(duì)照組(p<0.05)，用Western blotting法進(jìn)一步證

7、實(shí)了CpG-ODN與CpG-ODN +氯喹組巨噬細(xì)胞上清中TLR-9蛋白的表達(dá)較Non-CpG-ODN及對(duì)照組明顯增加(p<0.05)。 (2) 巨噬細(xì)胞上清液中TNF-a水平CpG-ODN組明顯高于其他組，差異有顯著性(P<0.05)。而各組巨噬細(xì)胞上清液中IL-6，IL-12水平無(wú)顯著性差異(p>0.05)。 結(jié)論： CpG-ODN 刺激鼠巨噬細(xì)胞24小時(shí)后可引起鼠巨噬細(xì)胞TLR-9無(wú)論在蛋白水平還是在核酸水