豬流行性腹瀉病毒抗體間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的豬的一種急性、高度傳染性腸道疾病。近年來，PED流行強(qiáng)度和流行區(qū)域的不斷加強(qiáng)和擴(kuò)大，給該病的防控工作帶來了巨大挑戰(zhàn)。因此，建立一種快速、特異的PEDV抗體檢測方法十分必要，對該病的防控具有積極意義。
　　為了建立PEDV抗體間接ELISA檢測方法，本研究根據(jù)

2、GenBank發(fā)表的PEDV S1基因序列，利用Primer5.0軟件，設(shè)計了一對特異性引物，應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增得到一條2442bp的基因片段，將其克隆至pMD19-T克隆載體，經(jīng)雙酶切鑒定及測序結(jié)果的分析比較，結(jié)果顯示，該基因序列與GenBank發(fā)表的PEDV S1基因核苷酸序列同源性高達(dá)99％。根據(jù)S1基因優(yōu)勢抗原表位區(qū)基因序列，利用Primer5.0軟件，設(shè)計了一對特異性表達(dá)引物，以重組質(zhì)粒pMD19-T-S1為模板擴(kuò)增得到

3、一條798bp的基因片段，將其克隆至pET-32a(+)表達(dá)載體，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-S798，將其轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3)。含重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-S798的菌液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示重組蛋白表達(dá)分子量為45ku，與預(yù)期大小一致。利用His標(biāo)簽純化重組蛋白，SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示純化效果較好，無雜帶。Western-blotting鑒定表

4、明，純化的重組蛋白具有良好的抗原性。將純化的重組蛋白作為包被抗原，通過優(yōu)化各步反應(yīng)條件，分別建立了血清中PEDV IgG抗體、乳汁中PEDV IgA抗體兩種間接ELISA檢測方法。
　　血清中PEDV IgG抗體間接ELISA檢測方法的最佳反應(yīng)條件:抗原包被濃度為1.875μg/mL，37℃孵育2h后4℃包被過夜;血清稀釋度為1∶40，37℃作用1h;酶標(biāo)二抗稀釋度為1∶500，37℃作用45min;底物最佳顯色時間為15min。

5、建立的間接ELISA檢測方法不與TGEV、CSFV、PRV、PRRSV陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示變異系數(shù)均小于10％。與市售試劑盒相比，特異性為91％、敏感性為89％、符合率為90％，表明建立的間接ELISA檢測方法特異性強(qiáng)、敏感性高，為PEDV IgG抗體檢測提供了一種簡便快速的血清學(xué)診斷方法。
　　乳汁中PEDV IgA抗體間接ELISA檢測方法的最佳反應(yīng)條件:抗原包被濃度為0.938μg/mL，4℃包被過夜;乳