兔病毒性出血癥病毒SYBR Green RT--PCR檢測(cè)方法的建立及其基因工程疫苗免疫保護(hù)研究.pdf

1、兔出血癥（Rabbit hemorrhagic disease，RHD）俗稱兔瘟，是由兔出血癥病毒(Rabbithaemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一種高傳染性，高致死性的急性烈性傳染病，給養(yǎng)兔業(yè)和相關(guān)行業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。RHDV屬于杯狀病毒科(Caliciviridae)兔病毒屬(Lagovirus)，為單股正鏈RNA病毒，含有1條約7.4 kb的基因組和1條約2.2 kb的亞基因組。VP60是

2、RHDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒的免疫保護(hù)性抗原，是RHD診斷和疫苗研發(fā)的重要分子。
　　RHD無(wú)有效的治療手段，目前控制的主要措施為疫苗免疫預(yù)防。為了更好地控制和預(yù)防兔出血癥，本論文從RHDV的檢測(cè)和RHD基因工程疫苗的免疫保護(hù)機(jī)制兩方面進(jìn)行研究。根據(jù)VP60蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物建立兔出血癥病毒SYBR GreenRT-PCR檢測(cè)方法，利用該方法對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)不同樣品中病毒含量的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析;另外從體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答兩方

3、面評(píng)估兔出血癥基因工程疫苗的免疫保護(hù)機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.兔出血癥病毒SYBR Green RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用
　　根據(jù)兔出血癥病毒的VP60蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過(guò)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的摸索和優(yōu)化，建立了重復(fù)性好、敏感性強(qiáng)的RHDV SYBR Green RT-PCR檢測(cè)方法，可有效檢出重組質(zhì)粒為14.6拷貝/μL的樣品。利用該方法對(duì)RHDV感染兔6h、12h、24 h、30h、36h的血清、肝、

4、脾中的病毒含量動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，血清、肝、脾三種樣品中病毒含量均呈現(xiàn)時(shí)間依賴效應(yīng)，隨著時(shí)間增加，其病毒含量呈現(xiàn)幾何數(shù)增長(zhǎng)。家兔感染RHDV12h、24h、30h及36h后，血清中病毒含量分別達(dá)到約105、106、107、108拷貝數(shù);肝臟中病毒分別達(dá)到約105、108、108、109拷貝數(shù);脾臟中病毒含量分別達(dá)到約105、108、108、108拷貝數(shù)左右;肝臟中的RHDV含量最高，說(shuō)明肝臟是其主要的靶組織。
　　2.兔出

5、血癥基因工程疫苗免疫保護(hù)機(jī)制的研究
　　為研究兔出血癥基因工程疫苗的免疫保護(hù)機(jī)制，以兔出血癥基因工程疫苗免疫健康易感家兔，同時(shí)設(shè)立組織滅活疫苗免疫組和PBS空白對(duì)照組，從體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答兩個(gè)方面評(píng)估疫苗的免疫效力。分別在免疫接種后0、3、7、14、21、28 d采集各組兔血液，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)血清中RHDV特異性抗體IgG和IgM水平以及細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、干擾素-γ（I

6、FN-γ）的水平變化;用血凝抑制(HI)檢測(cè)血液中總抗體的水平變化，于21d對(duì)所有試驗(yàn)動(dòng)物攻毒，以攻毒保護(hù)試驗(yàn)評(píng)估疫苗的免疫保護(hù)能力。試驗(yàn)結(jié)果表明，免疫后7天、14天和21天，組織滅活疫苗組和基因工程疫苗組血清中特異性抗體IgG、IgM均顯著升高，與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）;基因工程疫苗組與對(duì)照組相比，免疫后3天、7天和14天血清中IL-2、IL-4和IFN-γ含量均顯著（P＜0.05）增高，組織滅活疫苗組與對(duì)照組相比，血清I

7、L-2含量無(wú)顯著(P＞0.05)差異，IL-4和IFN-γ含量顯著(P＜0.05)升高;與對(duì)照組相比，免疫后7天、14天、21天兩組疫苗組血清的血凝抑制效價(jià)均顯著升高(P＜0.05);同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，基因工程疫苗組誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體(IgG、IgM)、細(xì)胞因子（IL-4、IFN-γ）均比組織滅活苗組高，且免疫后3天、7天、14天、21天以及28天基因工程疫苗組血清中IL-2顯著（P＜0.05）高于組織滅活苗組;攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種疫