豬細(xì)小病毒SYBR Green real-time PCR檢測方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、豬細(xì)小病毒（porcineparvovirus，PPV）是引起母豬繁殖障礙的主要病原體之一，其特征是孕前期受到感染，經(jīng)胎盤使胚胎受到侵襲，引起初產(chǎn)母豬流產(chǎn)、胚胎死亡、胎兒畸形、胎兒木乃伊化及不孕等，同時還可以引起仔豬的皮炎和腹瀉，其它類型的豬感染后無明顯臨床特征。豬細(xì)小病毒病存在于世界各地并在大多數(shù)豬場流行，嚴(yán)重影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，因此本病一直是豬病研究的熱點之一，PPV又常同豬偽狂犬病毒、乙型腦炎病毒、圓環(huán)病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征

2、病毒等混合感染而加重了其危害。近年來，PPV感染呈擴大上升的趨勢，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。所以，加強對PPV的檢測、監(jiān)測及預(yù)防十分緊迫。 目前，豬細(xì)小病毒病診斷方法主要有：病毒分離、血凝抑制試驗和乳膠凝集試驗等檢測方法，其中血凝抑制實驗相對簡便，但由于要制備豚鼠紅細(xì)胞以及被檢血清必須經(jīng)高嶺土或其它方法處理而顯得麻煩；乳膠凝集試驗的靈敏度不高，尤其是對隱性感染動物往往漏檢；病毒分離和鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但是該方法費時費力，并

3、且需要一定的技術(shù)條件和設(shè)備；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）及熒光定量PCR診斷具有靈敏度高、特異性強、快速、簡便等優(yōu)點成為診斷豬細(xì)小病毒的研究熱點。為此，我們進(jìn)行了以下研究： 1.利用PCR技術(shù)擴增出豬細(xì)小病毒VP2保守區(qū)基因194bp片段，并克隆到pGEMT載體上，純化的質(zhì)粒作為PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)模板，以10倍梯度稀釋質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)模板，進(jìn)行SYBRGreenI熒光定量PCR擴增并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了豬細(xì)小病毒的熒光定量PCR檢測方法。該

4、方法檢測靈敏度可達(dá)1.0×102拷貝/μL，與豬繁殖與呼吸綜合癥病毒，豬圓環(huán)病毒，豬乙型腦炎病毒，豬偽狂犬病毒，豬瘟病毒和豬流感病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性和重復(fù)性；對10份疑似病料和陰性病料進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)10份均為熒光定量PCR陽性，而常規(guī)PCR只能檢測出7份陽性。結(jié)果表明，建立的實時熒光定量PCR具有特異、敏感、快速、定量、重復(fù)性好等優(yōu)點，可用于臨床PPV感染的檢測。 2.將豬細(xì)小病毒HN1株接種于PK-15細(xì)胞，

5、用熒光定量PCR方法研究了豬細(xì)小病毒增殖的基本特征與規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PK-15細(xì)胞中，病毒在接種后3小時開始增殖，在12-48小時增殖最為迅速，在48小時病毒達(dá)到增殖最高峰；研究還發(fā)現(xiàn)在24小時病毒開始加速釋放，72小時達(dá)到最高峰。該結(jié)果為疫苗生產(chǎn)提供了試驗基礎(chǔ)，同時也為研究豬細(xì)小病毒病理學(xué)研究提供了試驗基礎(chǔ)。 3.豬精液中含有高濃度的蛋白質(zhì)，因此提取高純度DNA較為困難；試驗分別用水煮法、異硫氰酸胍法和Trizol法三種方法對