豬病毒性腹瀉PCR檢測方法建立與流行病學(xué)調(diào)查.pdf

1、生豬養(yǎng)殖是我國畜牧產(chǎn)業(yè)的重要支柱，但隨著我國生豬養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模化、集約化發(fā)展，導(dǎo)致各種疾病頻發(fā)，其中豬腹瀉更是制約我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要原因之一，給我養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。近年來，我國大部分地區(qū)包括貴州省的養(yǎng)豬場發(fā)生了不同程度的腹瀉。引起豬發(fā)生腹瀉的原因有很多，包括寄生蟲感染、細(xì)菌感染、病毒感染及飼養(yǎng)管理等因素，但以病毒感染較為常見，其中的病原主要有豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬輪狀病毒(PoRV)。為此

2、，本文首先建立了針對(duì)豬病毒性腹瀉主要病原的PCR檢測方法，并進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查和病原分子變異分析。具體研究內(nèi)容如下：
　　1.豬病毒性腹瀉病原PCR方法的建立：
　　(1)三重PCR方法的建立：根據(jù)Genbank提供的PEDV S基因、TGEV M基因和PoRV VP7基因參考序列，設(shè)計(jì)三對(duì)特異性引物，以克隆的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PEDV、TGEV和PoRV三重 PCR檢測和反應(yīng)條件的優(yōu)化。結(jié)果：PEDV、TGEV和PoRV三重

3、PCR反應(yīng)體系最佳退火溫度為51℃，PEDV、TGEV和PoRV最適引物濃度分別為0.5μM/L、0.3μM/L和0.3μM/L，最低質(zhì)粒模板檢出量分別為1×102copies/μL、1×100opies/μL、1×103copies/μL；且該方法不能檢出豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)；對(duì)102份病料進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，病料中PEDV、TGEV和PoRV的檢出率分別為37.25％、1.

4、96%和6.86%。
　　(2)單項(xiàng)LAMP方法的建立：根據(jù)Genbank提供的PEDV M基因、TGEV N基因、PoRV VP7基因參考序列，設(shè)計(jì)6對(duì)特異性LAMP引物，以克隆的全基因重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PEDV、TGEV和PoRV LAMP的檢測和反應(yīng)條件的優(yōu)化。結(jié)果：PEDV、TGEV和PoRV單項(xiàng)LAMP方法最佳反應(yīng)溫度分別為60℃、64℃和62℃，最佳反應(yīng)時(shí)間為60min、60min和90min，最佳外引物與內(nèi)引物濃度

5、比為200 nmol/L:2400 nmol/L、200 nmol/L:2400 nmol/L和200 nmol/L:3200 nmol/L，最佳Mg2+濃度為2.5 mmol/L、1.0mmol/L和2.5mmol/L，最佳dNTP濃度0.8 mmol/L、0.6mmol/L和0.6mmol/L，最佳 Bst DNA聚合酶濃度為0.16U/μL、0.64U/μL和0.64U/μL，最低檢出量為1.0×102copies/μL、1.0×

6、101copies/μL和1.0×102copies/μL，相互間無交叉反應(yīng)；對(duì)12份病料檢測發(fā)現(xiàn)，PEDV、TGEV和PoRV的LAMP檢測與普通PCR方法檢測的符合率分別為75%、100%和100%。
　　2.貴州省豬病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查：
　　(1)發(fā)病情況調(diào)查：采用實(shí)地考察及問卷調(diào)查等方法對(duì)貴州省部分規(guī)模養(yǎng)豬場進(jìn)行豬腹瀉發(fā)病狀況調(diào)查、臨床癥狀與病理變化觀察，結(jié)果：2013年~2015年，在調(diào)查的13個(gè)規(guī)模養(yǎng)豬場中，

7、豬腹瀉發(fā)生率為61.07%(4368/7153)，病死率為71.50%(3123/4368)；仔豬腹瀉主要發(fā)生于4~21日齡，發(fā)病時(shí)間主要在冬春季節(jié)；成年豬多表現(xiàn)為隱性感染；仔豬主要表現(xiàn)為水樣腹瀉，病變主要在胃腸道，組織病變表現(xiàn)為小腸絨毛脫落。
　　(2)病原學(xué)調(diào)查：采集2013~2015年規(guī)模養(yǎng)豬場豬糞便樣本221份，采用建立的三重PCR方法進(jìn)行PEDV、TGEV和PoRV病原核酸檢測，結(jié)果：PEDV、TGEV和 PoRV核酸檢

8、出率分別為59.45%(131/221)、0.92%(2/221)和6.91%(15/221)，且 PEDV與 PoRV、PEDV與 TGEV的混合感染率分別為5.88%(13/221)和0.90%(2/221)，不同豬群中哺乳仔豬PEDV、TGEV及PoRV的陽性率均為最高，分別為60.00%(96/160)、1.25%(2/160)及8.75%(14/160)。另外， PEDV檢出率呈逐年下降趨勢。
　　(3)血清學(xué)調(diào)查：收集

9、2013~2015年24個(gè)規(guī)模養(yǎng)豬場275份血清樣本，采用ELISA方法進(jìn)行PEDV、TGEV和PoRV抗體檢測，結(jié)果：免疫豬群中PEDV、TGEV和PoRV的血清抗體陽性率分別為43.09%(53/123)、39.02%(48/123)和42.28%(52/123)；未免疫豬群中PEDV、TGEV和PoRV的血清抗體陽性率分別為30.92%(47/152)，36.18%(55/152)和38.82%(59/152)。
　　3.P

10、EDV與PoRV分子流行病學(xué)調(diào)查：根據(jù)GenBank登錄的PEDV和PoRV基因序列，設(shè)計(jì)PEDV M基因、ORF3基因和PoRV VP7基因特異性引物，然后提取仔豬腹瀉臨床樣本RNA，進(jìn)行目的基因擴(kuò)增、克隆和測序，利用DNAStar和MEGA5.0軟件進(jìn)行序列分析。結(jié)果：(1)成功克隆到14株P(guān)EDV的ORF3基因，全長均為675bp，可編碼225個(gè)AA，核苷酸和氨基酸序列的同源性分別在95.1%~100%與95.1%~100%之間；

11、與經(jīng)典毒株 CV777的同源性分別在95.9%~97.2%與93.8%~96.4%之間，貴州流行株的ORF3基因核苷酸在第62、160、235、243、274、301、360、450和497位發(fā)生點(diǎn)突變，無插入或缺失；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，14株流行毒株與CV777株、美國毒株、越南和韓國毒株親緣關(guān)系較近，與疫苗株Attenuated DR13親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。(2)14株P(guān)EDV的M基因全長均為681bp，可編碼226個(gè) AA；核苷酸和氨基

12、酸序列的同源性分別在98.1%~100%與98.2%~100%之間；與經(jīng)典毒株 CV777的同源性分別在97.9%~99.1%與98.7%~99.1%之間，與弱毒株Attenuated DR13同源性分別在97.9%~98.1%與97.8%~98.2%之間，貴州流行株主要在第125、198、213、234、285、348和618位發(fā)生點(diǎn)突變；(3)成功克隆到4株P(guān)oRV的VP7基因，全長均981bp，可編碼326個(gè)AA，核苷酸和氨基酸序

13、列的同源性分別在95.5%~99.7%和96.6%~99.7%之間，與國內(nèi)外參考毒株的同源性分別為71.4%~97.1%和72.1%~99.1%，與G4型參考毒株的同源性分別為87.0%~97.1%和93.3%~99.1%；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，4株貴州流行株與G4型毒株處于同一個(gè)群，由此推測4株P(guān)oRV貴州流行株屬于G4型PoRV。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立了豬病毒性腹瀉主要病原PEDV、TGEV和PoRV三重PCR方法