豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型、豬偽狂犬病病毒SYBR Green-Ⅰ實(shí)時熒光定量PCR方法及多重SYBR Green-Ⅰ實(shí)時熒光PCR方法的建立.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)、豬圓環(huán)病毒II型(Porcinecircovirustype2，PCV-2)、豬偽狂犬病病毒(Porcinepseudorabiesvirus，PRV)是3種重要的豬傳染病病原，流行病學(xué)調(diào)查表明，上述3種病毒廣泛存在于豬群當(dāng)中，且常?；旌透腥矩i群而引起發(fā)病。雖然針對每一種病原的診斷方法已然廣泛應(yīng)用，但是常規(guī)

2、的病原學(xué)、血清學(xué)診斷方法由于其費(fèi)時、費(fèi)力等劣勢已很難滿足實(shí)際生產(chǎn)的需要，因此，建立一種省時、省力、自動化程度且可以同時檢測3種病原的方法就顯得尤為重要。 實(shí)時熒光定量PCR是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種檢測核酸分子的新技術(shù)，SYBRGreen-I作為一種非序列特異性的熒光染料被廣泛地應(yīng)用與熒光定量PCR中，其原理是在PCR體系中加入SYBRGreen-I，通過熒光強(qiáng)度的變化，可以對PCR過程進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可以對

3、未知樣品中的核酸分子進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，也可以通過溶解曲線對未知樣品進(jìn)行定性分析?；赟YBRGreen-I的定量PCR方法與其它類型的定量方法相比具有簡便易行、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，目前，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用與生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域。本研究擬應(yīng)用SYBRGreen-I實(shí)時熒光PCR技術(shù)建立檢測PRRSV、PCV-2、PRV的快速診斷方法。 本研究首先根據(jù)GenBank登錄的PRRSVN蛋白基因、PCV-2rep蛋白基因和PRVgE基因的

4、核酸序列設(shè)計(jì)三對特異引物，各病毒擴(kuò)增片段長度為：PRRSV81bp、PCV-2130bp、PRV130bp，將這3個基因的部分核酸序列進(jìn)行克隆并測序，然后將3種病毒的重組質(zhì)粒測OD260，計(jì)算得出其濃度：拷貝/μL，并進(jìn)行梯度稀釋，將其作為標(biāo)準(zhǔn)品分別建立3種病毒SYBRGreen-I實(shí)時熒光定量PCR方法，建立的3種病毒的實(shí)時熒光定量PCR方法相關(guān)系數(shù)(R2)分別為：PRRSV0.998、PCV-20.996、PRV0.983，擴(kuò)增效率

5、分別為：PRRSV1.01、PCV-20.92、PRV0.98。PRRSV特異性試驗(yàn)顯示，對照組PCV-2、PRV、PPV、CSFV均無特異性擴(kuò)增；PCV-2特異性試驗(yàn)顯示，對照組PRRSV、PRV、PPV、CSFV均無特異性擴(kuò)增；PRV特異性試驗(yàn)顯示，對照組PRRSV、PCV-2、PPV、CSFV均無特異性擴(kuò)增。敏感性試驗(yàn)表明，3種病毒定量PCR方法的檢測敏感性可達(dá)：PRRSV25拷貝/μL、PCV-250拷貝/μL、PRV50拷貝/

6、μL。3種病毒3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)性試驗(yàn)表明，PRRSV(100、50、25拷貝/μL)批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)分別為1.15％、2.12％、2.45％，批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)分別為2.59％、2.23％、2.63％；PCV-2(1000、100、50拷貝/μL)批內(nèi)重復(fù)性變異系數(shù)分別為1.26％、1.07％、1.44％，批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)分別為4.44％、2.19％、2.14％；PRV(1000、100、50拷貝/μL)批內(nèi)重復(fù)性變

7、異系數(shù)分別為2.64％、2.64％、2.79％，批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)分別為4.83％、3.52％、3.94％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種病毒的SYBRGreen-I熒光定量PCR方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性。 在建立了3種病毒熒光定量PCR的基礎(chǔ)之上，我們將3種病毒的引物放入同一定量PCR管中，利用3種病毒擴(kuò)增產(chǎn)物TM值的不同，建立了多重SYBRGreen-I實(shí)時熒光定性PCR方法，對PRRSV、PCV-2、PRV進(jìn)行定性分析

8、，該方法通過溶解曲線分析，可以同時區(qū)分3種病毒，實(shí)驗(yàn)中確定3種病毒擴(kuò)增產(chǎn)物的TM值分別為：PRRSV82.8-83.8℃、PCV-284.96-85.68℃、PRV92.1-93.28℃。特異性試驗(yàn)表明，PRRSV、PCV-2、PRV有特異性的峰值出現(xiàn)，而PPV、CSFV及陰性對照無特性性的峰值產(chǎn)生；敏感性試驗(yàn)表明，單獨(dú)檢測各病毒時，PRRSV、PCV-2的敏感性可以達(dá)到250拷貝/μL，PRV可以達(dá)到500拷貝/μL；重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表

9、明，3種病毒的TM值批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)分別為：PRRSV0.12％、PCV-20％、PRV0.1％，批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)分別為：PRRSV0.10％、PCV-20.07％、PRV0.05％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種病毒的多重SYBRGreen-I實(shí)時熒光定性PCR方法具有較好的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。 本研究成功建立了PRRSV、PCV-2、PRV3種病毒的SYBRGreen-I實(shí)時熒光定量PCR方法及多重SYBRGreen-