兔出血癥病毒RPA檢測方法的建立及間接ELISA檢測抗體的研究.pdf

1、兔病毒性出血癥（viral haemorrhagic disease of rabbits）是由兔出血癥病毒（rabbit haemorrhagic disease virus，RHDV）感染所引起的兔的一種急性、敗血性、高度接觸傳染性、高致死性的傳染性疾病，以全身實質(zhì)器官出現(xiàn)水腫、淤血和出血為主要特征。RHDV被分為G1～G5以及G6（RHDVa，又名RHDV抗原變異株）6種基因型。2010年首次報道了變異型RHDV，它在遺傳特性上與

2、RHDV的6個基因型有很大的差異，命名為RHDV2也稱為RHDVb。在歐洲野兔體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)一個能引起野兔發(fā)病的新型毒株與RHDV的基因組結構類似，被稱為歐洲褐色兔綜合癥病毒（EBHSV）。
　　本試驗利用RHDV病原建立了RHDV重組酶聚合酶等溫擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）檢測方法，通過生物信息學分析，將RHDV的VP60基因進行分段表達確定其抗原性，以此建立了間接ELIS

3、A方法。本研究主要包括以下四部分內(nèi)容：
　　1 RHDV毒株的分離與分子遺傳變異特性分析
　　在山東不同地區(qū)分離了3株RHDV毒株，分別命名為BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株，克隆RHDV病毒的VP60蛋白基因，通過VP60核酸序列進化樹分析顯示，3個毒株均屬G6（RHDVa）變異群，序列同源性比對分析顯示，BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株與Genbank中其它經(jīng)典型RHDV毒株核苷酸

4、序列同源性分別在90.2％～98.6%、90.5%～99.9%、89.4%～99.5%，BZ/2015株、LW/2015株和MY/2015株與Genbank中RHDV2毒株核苷酸序列同源性分別在82.6%～82.9%、82.5%～82.8%、81.5%～81.9%。2014年河北分離到HB毒株與1984年江蘇首次分離的WX84毒株遺傳距離很近，推測其很可能來自毒株WX84株，近幾年，中國從西北、華東、東北和西南四大地區(qū)分離到的具有代表性

5、的RHDV毒株與WX84株差異較大，說明RHDV發(fā)生了變異，但是四大地區(qū)之間的RHDV毒株差異不大，且同世界其他國家和地區(qū)RHDV分離株基因序列幾乎沒有差異，同源性達到90%以上，因此，病毒基因型和流行的地域性沒有必然聯(lián)系。2 RPA檢測方法的建立
　　根據(jù)BZ/2015株的VP60基因的核酸序列，設計1對特異性引物，優(yōu)化反應條件，建立了RHDV重組酶聚合酶等溫擴增檢測方法。通過敏感性、特異性、人工感染和臨床應用等表明，該方法能特

6、異擴增出特異片段，檢測靈敏度達到0.1 LD50，與常規(guī)一步法RT-PCR敏感性相同。該方法具有較好的穩(wěn)定性、敏感性和特異性。重組酶聚合酶等溫擴增反應過程總耗時30 min左右，RPA檢測方法和一步法RT-PCR的檢出符合率為100%。
　　3 VP60基因分段表達及抗原性分析
　　VP60基因分為3個區(qū)域VP60-1（2aa-208aa）、VP60-2（174aa-425aa）和VP60-3（342aa-579aa）。VP

7、60-1、VP60-2、VP60-3和VP60分別克隆到原核表達載體pET32a（+）和pColdⅢ中，4個重組質(zhì)粒分別命名為pET-VP60-1、pET-VP60-2、pET-VP60-3和pCold-VP60。
　　對VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60基因進行IPTG誘導表達，重組蛋白進行SDS-PAGE和Western blot分析。SDS-PAGE結果顯示表達的重組蛋白VP60-1、VP60-2、VP60-

8、3和VP60條帶大小，與預期大小一致。將表達的重組蛋白純化后的蛋白進行Western blot檢測結果表明，表達的重組蛋白VP60-1、VP60-2、VP60-3和VP60均能和RHDV陽性血清發(fā)生特異性反應。
　　4 ELISA方法建立
　　利用純化的VP60分段蛋白作為包被抗原，以兔出血癥病毒陽性血清為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG為二抗建立間接ELISA檢測方法。分別用ELISA方法和HI試驗對7只6周齡SPF兔免疫R