重組人纖溶酶原激活劑(rhPA)轉(zhuǎn)基因兔純合子的篩選及表達(dá)特性.pdf

1、血栓性疾病是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和生命的疾病，可累及全身各個(gè)器官及系統(tǒng)，目前利用溶栓藥物成為治療此類(lèi)疾病的主要方法。溶栓藥物經(jīng)過(guò)不斷研究已發(fā)展到第三代，其中以重組人纖溶酶原激活劑(r-tPA)作為治療人類(lèi)血栓性疾病的新型藥物。重組人組織纖溶酶原激活劑與天然t-PA具有相似的生物學(xué)活性，更具有溶栓能力強(qiáng)、與纖維蛋白親和力高、全身出血副作用小、半衰期長(zhǎng)、總使用劑量少等特點(diǎn)。作為第三代溶栓藥物的新型代表，重組人纖溶酶原激活劑越來(lái)越受到血栓病患

2、者的青睞，具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　外源基因在轉(zhuǎn)基因純合子動(dòng)物的整合拷貝數(shù)是轉(zhuǎn)基因半合子動(dòng)物的兩倍。本研究旨在篩選出轉(zhuǎn)rhPA基因純合子兔，比較外源基因rhPA在轉(zhuǎn)基因純合子兔和轉(zhuǎn)基因半合子兔乳腺中的表達(dá)水平，探索在整合位點(diǎn)相同時(shí)，rhPA在轉(zhuǎn)基因兔乳腺中的表達(dá)量與其拷貝數(shù)之間的關(guān)系。篩選高水平表達(dá)的轉(zhuǎn)基因純合子兔，培育用于生物制藥的rhPA的轉(zhuǎn)基因純合子兔品系，為以后大規(guī)模制備溶血栓生物藥品建立基礎(chǔ)，并且用于藥理學(xué)和生物學(xué)活性分

3、析，有利于后期藥品開(kāi)發(fā)應(yīng)用。
　　本研究應(yīng)用已經(jīng)構(gòu)建的乳腺特異表達(dá)載體PCL25/rhPA，通過(guò)原核期受精卵顯微注射制備轉(zhuǎn)rhPA基因家兔。經(jīng)過(guò)PCR整合檢測(cè)和ELISA表達(dá)檢測(cè)篩選出原代轉(zhuǎn)基因表達(dá)兔。F1代轉(zhuǎn)基因表達(dá)兔兄妹同胞交配或回交獲得F2代轉(zhuǎn)基因兔，通過(guò)對(duì)F2代轉(zhuǎn)基因兔測(cè)交篩選出其中的轉(zhuǎn)基因純合子兔。ELISA檢測(cè)比較轉(zhuǎn)基因純合子兔與半合子兔乳清中rhPA的表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)以成年新西蘭母兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，將rhPA基

4、因片段通過(guò)顯微注射導(dǎo)入受精卵，移植受體64只，其中46只懷孕，出生仔兔207只，PCR整合陽(yáng)性兔56只，存活37只。妊娠率為71.9％，陽(yáng)性整合率為27.1％。
　　ELISA檢測(cè)37只轉(zhuǎn)基因兔（或后代）乳汁，其中12只兔乳腺特異性表達(dá)rhPA。
　　獲得的rhPA基因表達(dá)公兔K29與正常新西蘭母兔交配，共獲得了F1代仔兔25只，經(jīng)PCR檢測(cè)篩選出F1代轉(zhuǎn)基因兔16只，其中母兔10只，公兔6只。從F1代轉(zhuǎn)基因兔中挑選公兔和母

5、兔同胞交配，共獲得F2代仔兔10只，經(jīng)PCR檢測(cè)篩選出F2代轉(zhuǎn)基因兔5只，其中母兔4只，公兔1只。將F2代轉(zhuǎn)基因兔再與正常兔測(cè)交配種，通過(guò)對(duì)后代的PCR檢測(cè)，篩選出F2代中轉(zhuǎn)基因純合子兔。我們從F2代轉(zhuǎn)基因兔中篩選出2只雌性轉(zhuǎn)rhPA基因純合子兔（編號(hào)K29 F2-05和K29 F2-09）。通過(guò)對(duì)K29 F2-09奶樣的ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其乳汁中重組人纖溶酶原激活劑(rhPA)的表達(dá)水平明顯高于半合子轉(zhuǎn)基因兔。
　　本研究獲得

6、了乳腺特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因兔，建立了PCL25/rhPA轉(zhuǎn)基因兔基本繁殖群（K29系），并培育篩選出2只轉(zhuǎn)rhPA基因純合子母兔（編號(hào)K29 F2-05和K29 F2-09），經(jīng)ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示K29 F2-09母兔奶樣中的rhPA表達(dá)量明顯高于轉(zhuǎn)rhPA基因半合子兔。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證明PCL25/rhPA在轉(zhuǎn)基因純合子兔乳腺中的表達(dá)量高于轉(zhuǎn)基因半合子兔的表達(dá)量。
　　本研究驗(yàn)證了以培育轉(zhuǎn)基因純合子動(dòng)物來(lái)提高外源基因表達(dá)量的可行性