重組人抗PAI抑制作用的新型纖溶酶原激活劑突變體的表達與活性研究.pdf

1、血栓性急性心腦血管病是嚴重威脅人類健康的疾病。目前在治療這類疾病方面已經(jīng)取得了重大進展，溶栓治療是其中最為重要的技術之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全世界每年死于該類疾病的患者大約有1600萬人，我國每年患有這類疾病的人數(shù)也有500萬人。因此，研發(fā)出新的高效的溶栓藥物受到越來越多研究機構的重視。
　　組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，t-PA)是纖溶系統(tǒng)的生理性激活劑，由于t-PA與血栓基質(zhì)

2、纖維蛋白有很強的特異性親和力，能有效地在血栓局部激活纖溶酶原為纖溶酶而使血栓溶解。重組t-PA是利用基因工程技術開發(fā)出的用于治療心腦血管病的特效藥，與鏈激酶、尿激酶等溶栓劑比較具有作用快、不造成全身的纖維蛋白溶解、療效高等優(yōu)點，但是在臨床應用中也有很多不足，如在體內(nèi)可被肝細胞迅速清除，在血漿中存在纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)可快速抑制其活性。t-PA在血中的半衰期很短(1～5 min)，使臨床溶栓治療時為維持有效濃度需大劑量(

3、100～150 mg)，增加了系統(tǒng)性纖溶引起出血的危險。由德國的勃林格殷格翰(BoehringerIngelheim)制藥公司生產(chǎn)的瑞替普酶(rt-PA)和阿替普酶(CHO-t-PA)，已經(jīng)成功投放市場用于治療血栓性疾病。首先它們在體內(nèi)的半衰期延長到了18min，且增強了與纖維蛋白的結合力，并且還是可逆結合，大大提高了激活纖溶酶原的活性。其次可通過靜脈給藥，且降低了用藥劑量。但是它們的分子結構中有PAI-1的結合位點，血液中的PAI-1

4、與其結合從而抑制纖溶活性。有國外文獻報道血栓性疾病患者血中PAI-1濃度高于正常人，體外實驗也證實了5 U·mL-1的PAI-1可以使5ng·mL-1 rt-PA和天然CHO-t-PA失活，所以臨床用量仍較高。
　　因此研制半衰期長且活性不受PAI-1抑制、用量小、成本低、副作用小的t-PA突變體成為當務之急，本實驗室在重組t-PA的基礎上使PAI-1位點的堿基突變，去除了指狀區(qū)、表皮生長因子區(qū)和Kringle1區(qū)，使含有373-

5、384 PAI-1結合位點的rt-PA的基因序列AAG CAC AGGAGG突變?yōu)镚CG GCC GCG GCG，氨基酸KHRR相應變?yōu)锳AAA，構建了新的t-PA突變體，并克隆于大腸桿菌表達載體。本研究構建pBV220-t-PA重組表達質(zhì)粒，經(jīng)DNA測序確認后，轉化至大腸桿菌DH5α，溫控誘導表達，凝膠過濾法對包涵體蛋白進行初步純化，復性后，過刺桐胰蛋白酶親和層析柱純化，酶動力學分析其活性。測序證實t-PA突變體的DNA序列正確，表達