生物制藥論文-組織型纖溶酶原激活劑

1、<p><b>　　1　引言（或緒論）</b></p><p>　　組織型纖溶酶原激活劑(Tissue Type Plasminogen Activator, t-PA)激活纖溶酶原形成纖溶酶，是體內(nèi)纖溶系統(tǒng)的生理性激動(dòng)劑，在人體纖溶和凝血的平衡調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，是一種新型的血栓溶解劑。t-PA在組織和體液中含量甚微，分子量很大，從天然組織提取或人工合成藥用t-PA均有很

2、大難度。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用基因工程手法，從人胎盤染色體基因庫中篩選出TPA基因，將其雨質(zhì)粒結(jié)合，導(dǎo)入到人黑色素瘤細(xì)胞當(dāng)中，組建能夠表達(dá)t-PA基因的工程細(xì)胞。然后將人黑色素瘤細(xì)胞無血清連續(xù)培養(yǎng)，并運(yùn)用高效誘導(dǎo)劑，從而快速、大量地獲得了含組織型纖溶酶原激活劑(tPA)水平較高的培液。經(jīng)免疫親和層析、Sephadex G-150凝膠過濾，培液中t-PA得以快速有效地純化。將純化后的tPA與WHO標(biāo)tPA抗體作免疫鑒定。</p><

3、;p>　　2　組織型纖溶酶原激活劑簡述</p><p>　　2.1組織型纖溶酶原激活劑</p><p>　　原激活劑(PA)是以絲氨酸為活性中心的蛋白酶。它能將纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，在纖溶系統(tǒng)中有重要作用。同時(shí)，PA與細(xì)胞轉(zhuǎn)移、血液凝固、組織重建、激欣產(chǎn)生及原發(fā)性腫瘤的發(fā)生等生理和病理生理現(xiàn)象有密切的關(guān)系。</p><p>　　人纖溶酶原激活荊有尿激酶型（u

4、PA）及組織型(tPA)兩種主要類型。這兩種蛋白質(zhì)免疫性不同，分子量有區(qū)別，由不同的基因編碼。</p><p>　　tPA主要是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成的單鏈多肽，分子量約為68000，在纖溶酶或胰蛋白酶作用下，水解Arg275-Ilu276肽鍵，形成由二硫鍵連接的雙鏈結(jié)構(gòu)。氨基末端在重鏈，羧基末端在輕鏈。重鏈有兩個(gè)三角區(qū)結(jié)構(gòu)，并有與纖維結(jié)合素指形結(jié)構(gòu)有同源性的區(qū)域和生長因子樣區(qū)域等。輕鏈含有由His(322)}、As

5、p（371）、 Ser （478）組成的酶活性中心。</p><p>　　tPA對(duì)纖維蛋白原親和力很低，對(duì)纖維蛋白親和力極高,. tPA-纖維蛋白復(fù)合物能高效且特異地激活血凝塊中的纖溶酶原，形成纖溶酶，后者溶解血栓中的纖維蛋白，但幾乎不激活循環(huán)血液中的纖溶系統(tǒng)，因此，tPA是一種較為理想的血栓溶劑。</p><p>　　2.2　組織型纖溶酶原激活劑基因</p><p&g

6、t;　　1983年，Pennia等成功地構(gòu)建了編碼tPA的完整cDNA克隆，并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。該克隆的tPA ds- cDNA的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，也同樣出現(xiàn)在tPA基因中。</p><p>　　Ny的tPA基因，用限制性內(nèi)切酶水解，瓊脂糖凝膠電泳，與tPA探針作Sou-there固相分子雜交，然后將陽性片段克隆到M13，mP8mP9中，進(jìn)行順序分析，顯示了有以下結(jié)構(gòu)特征； </p>&

7、lt;p>　　tPA基因至少由13個(gè)內(nèi)含子分隔為14個(gè)外顯子，每一個(gè)內(nèi)含子5'端以G-T開始，3’-端以A-G結(jié)束。</p><p>　　tPA基因的14個(gè)外顯子，分別編碼tPA各個(gè)功鄰區(qū)域。</p><p>　　2.3　tPA基因的染色體定位</p><p>　　tPA基因以單拷貝存在于染色體中。1985年，Rajput等人用人-鼠體細(xì)胞融合，進(jìn)行基

8、因轉(zhuǎn)移，研究tPA與uPA基因的染色體定位。</p><p>　　他們用限制性內(nèi)切酶Hind}I分別消化人和鼠染色體DNA，將水解片段與tPA cDNA探針雜交，結(jié)果為tPA探針與人DNA/Hind耐班的強(qiáng)雜文帶為7kb，與鼠DNA/HindⅢ的強(qiáng)雜交帶為23kb。</p><p>　　然后他們隨機(jī)選擇了32個(gè)不同的融合細(xì)胞，其細(xì)胞DNA/Hind與tPA探針雜交的結(jié)果為:32個(gè)細(xì)胞中都有

9、23kb條帶，18個(gè)細(xì)胞中尚有7kb強(qiáng)雜交帶。其余24個(gè)融合細(xì)胞中7kb強(qiáng)雜交帶消失。進(jìn)一步作染色休組型核型鑒定發(fā)現(xiàn):含有7kb雜交條帶的18個(gè)融合細(xì)胞中都有第8對(duì)染色體，而24個(gè)不含7kb條帶的融合細(xì)胞中均不存在第8對(duì)染色體。因此證明人SPA基因定位于第8對(duì)染色體t 7 7。用同樣的方法，他們又確定了人uPA基因定位于第10對(duì)染色體。這個(gè)結(jié)論與過去提出的PA基因定位在第6對(duì)染色體是不相同的。</p><p>　

10、　3　t-PA工程細(xì)胞的制備</p><p>　　3.1　tPA cDNA探針的制備</p><p>　　本設(shè)計(jì)采用改良的Birnboim方法。大量制備tPA cDNA片段的重組質(zhì)粒pHS-2，經(jīng)Sepharose 2B柱分離，獲得純化質(zhì)粒。Pst水解pHS-2質(zhì)粒，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離并回收其中tPA cDNA片段，按NBN公司切口平移翻譯藥箱推薦的反應(yīng)條件，以α-32P CTP標(biāo)記

11、tPA cDNA片段，用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測定探針的放射性強(qiáng)度，計(jì)算比放射性。</p><p>　　3.2　人胎盤染色體基因庫優(yōu)選</p><p>　　將人胎盤染色體基因庫重組DNA隨機(jī)分為7個(gè)組份，每份取一定量用EcoRI消化2h，經(jīng)堿變性后與tPA cDNA探欽點(diǎn)雜交，探針強(qiáng)度為5 x 105-106cpm/ml雜交液，50℃雜交(5 xSET；5 x Denhardt's；0.1

12、NapyPO4；O,1%SDS；10%Na-Dextran sulfate，魚精DNA100-200ug/ml雜交液）20h。濾膜用2 x SSC,0.1%SDS溶液50℃洗滌3次，室溫下洗2次，然后進(jìn)行X光膠片放射自顯影。</p><p>　　3.3　人tPA基因克隆的分離:</p><p>　　取基因庫強(qiáng)雜交組份(PLS) DNA按Mandel方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101細(xì)胞，計(jì)算轉(zhuǎn)化率

13、。</p><p>　　參考Grosveld，F(xiàn).等方法，用菌落原位雜交分離含tPA基因的陽性克隆。雜交條件與點(diǎn)雜交相同。根據(jù)X光膠片上強(qiáng)感光點(diǎn)位置，挑取陽性菌落。因印片上菌落密度過大，難以挑到單個(gè)克隆，為此進(jìn)行了再篩選。選取單個(gè)陽性菌落制備cosmid作進(jìn)一步研究。</p><p>　　3.4　人tPA基國的鑒定</p><p>　　用堿抽提法制備6個(gè)陽性菌落的D

14、NA，DNA分別用B g1Ⅱ,EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ水解。其中t3 DNA取4份。分別用EcoRⅠ、PstⅠ、BamH Ⅰ和Hind Ⅲ水解，水解片段用Souhern雜交進(jìn)行鑒定。</p><p>　　3.5　DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞</p><p>　　本設(shè)計(jì)采用人黑色素瘤細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，陽性克隆t3cosmindDNA與質(zhì)粒Psv22-dhfr工轉(zhuǎn)化人黑色素瘤細(xì)胞，并篩選、鑒定tPA成功表

15、達(dá)的細(xì)胞。</p><p><b>　　4　工程細(xì)胞的培養(yǎng)</b></p><p><b>　　4.1　試劑</b></p><p>　　Eagle培養(yǎng)基，蛋白酶抑制劑、纖溶酶(Kabi Vitrum)，WHO標(biāo)準(zhǔn)tPA (83/517)及tPA抗體，兔抗人UK及t PA抗血清。</p><p>&

16、lt;b>　　4.2　細(xì)胞培養(yǎng)</b></p><p>　　Bowes人黑色素瘤細(xì)胞用EagIe培養(yǎng)液在大圓瓶中轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)，培液中尚含0.06%谷氨酸胺、青霉素100u/ml，鏈霉素100u/ml及10%小牛血清。每平方米表面加培液2.5L，待細(xì)胞長滿單層，移去培液，用pH7.4 0.1mol/L磷酸鹽緩沖液生理鹽水(PBS)洗細(xì)胞二次，換以含誘導(dǎo)劑的無血清培液。以后每三天收獲并更換培液一次，連續(xù)

17、培養(yǎng)。</p><p>　　5　t-PA的制備和提取</p><p>　　5.1　tPA活性的測定</p><p>　　采用纖維蛋白板溶圈法測定tPA活性，以}WHO標(biāo)準(zhǔn)品t-PA作標(biāo)準(zhǔn)。作抗體抑制t-PA活性測定時(shí)，在板申混入一定量的抗t-PA或抗UK JgG。</p><p><b>　　5.2　蛋白質(zhì)定量</b>&

18、lt;/p><p>　　用考馬斯亮蘭G-250結(jié)合法，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。</p><p>　　5.3　雙鏈tPA的制備</p><p>　　取纖溶酶10mg，與2ml嗅化氰活化的Sepharose 4B交聯(lián)制備纖溶酶-Sepharose4B。取lrnl t-PA溶液(約100ug)加至纖溶酶-Sepharose 4B中，25℃反應(yīng)2h后，濾去纖溶酶--Sephar

19、ase 4B。</p><p>　　5.4　SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳</p><p>　　參照Laemmli坊法，用8%分離膠和4%濃縮膠。樣品以琉基乙醇還原，銀染色觀察結(jié)果。</p><p>　　5.5　細(xì)胞培養(yǎng)液提純</p><p>　　無血清連續(xù)培養(yǎng)人黑色素瘤細(xì)胞獲得的培液，加入蛋白酶抑制劑aprotinin, Tween-80至0

20、.01%后，抽濾。</p><p>　　5.6　免疫親和層析</p><p>　　5.2.1免疫親和層析柱制備</p><p>　　tPA與福氏完全佐劑免疫家兔，每隔兩周再以100ug--t PA加強(qiáng)免疫兩次，獲得了抗血清。分離抗t-PA IgG，與Sepharose 4B交聯(lián)制成特異免疫親和層析柱。</p><p>　　5.2.2　免疫親和

21、層析</p><p>　　2L培液以40m1/h親和層析柱，以0.1mol/L, pH7.4PBS,0.25mol/L KSCN, 25kIU/ml aprotinin、0.01%Tween-80(平衡液)洗脫未吸附蛋白后，用含3.0mol/L KSCN的平衡液洗脫tPA。收集t PA活性高峰部分，對(duì)高滲液濃縮。</p><p>　　5.3　 Sephadex G-150凝膠過濾</

22、p><p>　　Sephadex G-150柱（2.5*80.0cm）以1.0mol/L NH4HC03、 0.01 % Tween-80平衡，加入經(jīng)免疫親和層析后的t-PA樣品，用平衡液洗脫。收集t-PA活性高峰，冷凍干燥。</p><p><b>　　參 考 文 獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] Weimar,W.et aI,:Laf

23、l,Cet, 2:1D18,1981.</p><p>　　[2]　頤銀良:生命的化學(xué)，8:21,1988</p><p>　　[3]　Nr.T.et aI,:Proc.Nartl. cid.Sci.U.S.A.5366,1984</p><p>　　[4]　王結(jié)義等:上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，14:179, 1987,</p><p>　　[5]

24、　Verstraete, M,et al:Lancet, 7:842, 1985,</p><p>　　[6]　Yerstraete, M,et aI,:Lancet, 2:965, 1985.</p><p>　　[7]　Co11en,D,et ai,:Circulatian,T3:511, I9ss.</p><p>　　[8]　Dssowski,L,et

25、 al,:Cell, 16:s2s, ls7s,</p><p>　　[9]　Martin, O,et al,; Am, T, Ob3tet. Gyncol., 142:442, 1as2</p><p>　　[10]　Rifkirs, D,B, et滋.:T,L}xp,Med., 139:1317,197x.</p><p>　　[11]　王結(jié)義等:上海醫(yī)

26、科大學(xué)學(xué)報(bào)，14 fig) :179, 1987,</p><p>　　[12]　Braad#}d, M, M, et al:Anal Bioaheln 72:zas, is7s,</p><p>　　[13]　l.aemmli, U.K, et al,:Nature, 227:ssa, Is7o:</p><p>　　[14]　Wallen, P,et a

27、l,:石ur.l. 13iochern,>132as1, 19s3.</p><p>　　[15]　Kraithof, E,K.O, et al,:Bioeheln. J. 226:ss1，1985.</p><p>　　[16] 　Pennica, D, et aI,:Nature, 3U1:z14,.i9s3.</p><p>　　[17]　Klaus