吸血蝙蝠唾液纖溶酶原激活劑在畢赤酵母中的表達(dá)及純化研究.pdf

1、本文對(duì)吸血蝙蝠唾液纖溶酶原激活劑在畢赤酵母中的表達(dá)及純化進(jìn)行了研究。文章在體外人工合成吸血蝙蝠唾液纖溶酶原激活劑 Bat-PA (H) 的全長(zhǎng)基因，并在基因序列5’和3’端分別引入His6，再將其克隆到表達(dá)載體pPIC9K上，成功構(gòu)建出His6-Bat-PA/pIC9K和Bat-PA-His6/pPIC9K重組質(zhì)粒。然后，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母GS115中，經(jīng)過(guò)G418濃度梯度抗性篩選、小量表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)

2、及纖溶平板測(cè)活，獲得高拷貝高表達(dá)的Bat-PA酵母菌株。利用單一實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)Bat-PA酵母菌株的發(fā)酵過(guò)程中的五個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，獲得一個(gè)較優(yōu)的發(fā)酵表達(dá)條件：pH=5.5，補(bǔ)加甲醇量2.0％/24h，4∶1接種，96小時(shí)發(fā)酵，10/50通氣量。通過(guò)甲醇誘導(dǎo)分泌型表達(dá)獲得重組的帶His-tag的Bat-PA蛋白，其分子量約為66KD。由于His-tag的存在，經(jīng)過(guò)Ni<'2+>親和層析柱純化，最終可從每升發(fā)酵液中獲得20-30mg目的蛋