重組組織型纖溶酶原激活劑-RGDS肽融合蛋白的表達(dá)、純化及鑒定.pdf

1、目的：人組織纖溶酶原激活劑（tPA）屬于絲氨酸蛋白酶家族。它能將纖溶酶原轉(zhuǎn)換成纖溶酶，在臨床用于血栓性疾病的治療。通過原核表達(dá)和純化重組組織型纖溶酶原激活劑(tPA)-RGDS肽融合蛋白，并初步鑒定其生物學(xué)活性，為靶向性研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：1)設(shè)計(jì)引物利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法使基因重組獲得目的基因片段tPA-RGDS，插入帶有His標(biāo)簽的高效可溶性表達(dá)載體pQE30中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pQE30-tPA-RGDS；將

2、重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（Escherichia coli, E.coli）BL21，經(jīng)自誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)目的基因表達(dá)；對(duì)融合蛋白His-tPA-RGDS用Ni-NTA親和層析柱純化；最后用纖維蛋白平板法評(píng)價(jià)其生物活性。
　　2)利用 PCR方法使基因重組獲得目的基因片段3C-tPA-RGDS，優(yōu)化原核表達(dá)條件（表達(dá)載體、表達(dá)菌、誘導(dǎo)溫度)，插入帶有His標(biāo)簽的原核高效可溶性表達(dá)載體 pW28中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pW28-3C-tP

3、A-RGDS，將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Origami2，經(jīng)自誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)目的基因表達(dá);對(duì)融合蛋白 His-3C-tPA-RGDS用Ni-NTA親和層析柱和DEAE陰離子交換層析柱純化，再用PreScission蛋白酶切3C蛋白從而切除His標(biāo)簽，用分子篩純化和分析融合蛋白tPA-RGDS聚集狀態(tài)，以SDS-PAGE分析其表達(dá)量和純度,用Western blot鑒定tPA-RGDS，最后用纖維蛋白平板法評(píng)價(jià)其生物活性。
　　結(jié)果

4、：構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pQE30-tPA-RGDS和pW28-3C-tPA-RGDS經(jīng)PCR、雙酶切鑒定及基因測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功；His-tPA-RGDS和His-3C-tPA-RGDS融合蛋白在大腸桿菌中獲得可溶性上清表達(dá)；His-3C-tPA-RGDS融合蛋白在原核表達(dá)體系（pW28載體、Origami2菌株及37℃誘導(dǎo)溫度）得到了最優(yōu)的表達(dá)；通過 PreScission蛋白酶成功去除His標(biāo)簽，得到 tPA-RGDS融合蛋白，SDS-P