大鼠肝細胞銅配合物結(jié)合的蛋白質(zhì)組的研究.pdf

1、順鉑的發(fā)現(xiàn)開辟了癌癥治療的新領(lǐng)域，金屬配合物藥物也因此引起了人們的廣泛關(guān)注并成為生物無機化學(xué)十分活躍的研究領(lǐng)域之一。人們用不同的金屬離子和配體設(shè)計合成了各種各樣的金屬配合物并研究了它們的各種生物活性，如抗腫瘤，抗菌，抗瘧疾和抗病毒等。然而，藥物的毒副作用和耐藥現(xiàn)象一直困擾著人們，因此，尋找高效低毒的金屬藥物是目前面臨的一個重大挑戰(zhàn)。
　　銅，作為生物體內(nèi)的必需元素，與非生命金屬如鉑、金相比具有較小的毒副作用，因此，銅配合物作為診斷

2、和治療疾病的潛在藥物引起了人們極大的關(guān)注。最近的研究顯示銅配合物可以通過抑制蛋白酶體的活性誘導(dǎo)癌絀胞凋亡。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的具有選擇性的低毒高效的靶向藥物設(shè)計發(fā)展迅速，人們發(fā)現(xiàn)銅配合物能夠抑制許多與重大疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)的活性，比如異檸檬酸裂合酶，拓撲異構(gòu)酶Ⅰ和Ⅱ，脲酶和蛋白酪氨酸磷酸酶等。以上的研究結(jié)果使猜想生物體內(nèi)可能存在一個銅配合物結(jié)合的蛋白質(zhì)組能夠與銅配合物強烈結(jié)合從而影響細胞的生理代謝。然而，它是如何與銅配合

3、物相互作用并影響生理代謝的呢？是否能夠篩選出選擇性抑制某種或少數(shù)幾種蛋白質(zhì)活性的銅配合物？探究以上問題并能夠取得一定的進展將對人們認識銅配合物的生理和藥理作用，篩選與某種重要蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的低毒高效的銅配合物藥物具有非常重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景。
　　本論文基于課題組提出的“銅配合物結(jié)合的蛋白質(zhì)組學(xué)”的概念，旨在探究肝細胞中銅配合物結(jié)合的蛋白質(zhì)組，篩選對某種蛋白質(zhì)有一定的選擇性抑制作用的銅配合物，為針對某種重要蛋白質(zhì)的靶向

4、藥物設(shè)計和篩選低毒高效的銅配合物藥物，揭示銅配合物的生理藥理、藥效和毒性提供理論依據(jù)和科學(xué)數(shù)據(jù)。主要研究成果如下:
　　(1)用銅親和層析柱和質(zhì)譜分離和鑒定大鼠肝細胞中的銅結(jié)合的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)肝細胞中至少存在97種銅結(jié)合的蛋白質(zhì)。通過陰（陽）離子交換柱純化上述銅結(jié)合的蛋白質(zhì)，得到五種豐度較高的銅結(jié)合的蛋白質(zhì)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定，分別是蘋果酸脫氫酶(MDH)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，過氧化氫酶(CAT)，鈣網(wǎng)蛋白(CRT)和白蛋白(Alb)。<

5、br>　　(2)通過酶活性抑制實驗和熒光光譜法研究了11種銅配合物與三種銅結(jié)合的蛋白質(zhì)(AST，MDH和CAT)的相互作用。結(jié)果表明，單核席夫堿銅配合物對AST的抑制能力較強，對MDH和CAT的抑制能力較弱。在配合物1-11中，席夫堿銅配合物6對AST的抑制能力最強，IC50值為3.6μM。重要的是，細胞實驗表明配合物6能夠進入細胞并能夠抑制細胞內(nèi)AST的活性。這些結(jié)果表明，銅配合物的結(jié)構(gòu)影響它們對不同酶的抑制能力和選擇性，合理設(shè)計銅配

6、合物的結(jié)構(gòu)有利于篩選出針對某種銅結(jié)合的蛋白質(zhì)抑制能力強，選擇性高的銅配合物抑制劑。
　　(3)以席夫堿為配體，設(shè)計合成了11種銅配合物并對其結(jié)構(gòu)進行了充分表征，研究了這些配合物與五種銅結(jié)合的蛋白質(zhì)(MDH，AST，CAT，PTP1B和TCPTP)的相互作用，發(fā)現(xiàn)銅配合物12，14，15對TCPTP有較強的抑制能力并表現(xiàn)出一定的選擇性，銅配合物13選擇性抑制PTP1B的活性。進一步研究了銅配合物12-15對細胞內(nèi)PTP1B，TCPT

7、P和AST活性的抑制情況。結(jié)果顯示，銅配合物14和15強烈地增強了細胞內(nèi)TCPTP底物的磷酸化水平，說明配合物14和15能夠進入細胞并對細胞內(nèi)TCPTP有較強的抑制能力，但二者對細胞內(nèi)AST和PTP1B活性無明顯影響，說明配合物14和15對細胞內(nèi)TCPTP具有一定的選擇性。這些結(jié)果表明，銅配合物和銅結(jié)合的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)共同影響其抑制活性和選擇性，合理地修飾有機配體部分可實現(xiàn)篩選出針對某種酶抑制能力強，選擇性高的銅配合物抑制劑。
　　

8、(4)設(shè)計合成13種其它金屬（鋅，釩，鋱）配合物并對其進行了充分表征，研究了這些配合物與五種銅結(jié)合的蛋白質(zhì)(MDH，AST,CAT，PTP1B和TCPTP)的相互作用。酶活性抑制實驗表明，配合物23-35對MDH，AST和CAT幾乎沒有抑制能力，鋅配合物23對TCPTP抑制能力較強且具有一定的選擇性，而釩配合物31選擇性抑制PTP1B的活性。蛋白免疫印跡實驗表明，釩配合物31強烈地增強細胞內(nèi)PTP1B底物的磷酸化水平，說明配合物31能夠

9、進入細胞并對細胞內(nèi)PTP1B有較強的抑制能力。MTT比色法表明釩配合物31的毒性比VOSO4弱。以上實驗結(jié)果表明，席夫堿鋅配合物和氧釩配合物作為蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑比銅配合物可能具有更低的毒性，釩配合物31有望成為抗糖尿病藥物開發(fā)的候選者之一。
　　以上研究表明:生物體內(nèi)的確存在能夠與銅配合物相互作用并影響細胞生理代謝的銅配合物結(jié)合的蛋白質(zhì)組。銅配合物結(jié)構(gòu)不同，與不同的銅結(jié)合的蛋白質(zhì)的結(jié)合能力和選擇性就不同;配體相同的前提下，配