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文檔簡介
1、肝細胞癌(HCC)是世界范圍內的惡性腫瘤之~,有較高的發(fā)病率和死亡率。乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的慢性感染是人HCC發(fā)生的最重要的危險因素。特別在中國,絕大多數HCC患者是HBV感染陽性??紤]到現在對HCC仍缺乏有效的診治手段,對HBV感染HCC的重要癌變相關分子進行發(fā)掘仍然很迫切并且必要。 蛋白質組學作為全面分析蛋白質表達變化的有力研究工具,已廣泛應用到疾病特別是腫瘤研究之中。在人類疾病蛋白質組學研究中,人
2、體樣本是最有價值和說服力的實驗材料。樣本收集是重要的基礎工作,需要對樣本的入組選擇、采集方法、處理步驟、貯存條件以及信息登記等做詳細的規(guī)范,以期建立適用于蛋白質組學、代謝組學以及轉錄組學研究的樣本庫。在此基礎上,對HCC及其健康對照、乙型肝炎、肝硬化病人的各類臨床樣本進行了收集,包括血漿、血細胞、血清、尿液和組織。 定量分析是蛋白質組學研究的重要組成部分,對方法學有較高的要求,需要對生物樣品之間的蛋白質差異表達值提供準確和重復性
3、好的分析。DIGE是定量蛋白質組學方面的一個進步,與傳統2DE相比,DIGE可以提供更為準確的定性和定量分析。首先對DIGE實驗進行了3方面的評價:2DE重復性評價、標記實驗和標記評價,都獲得了較好的標記和定量效果。然后利用DIGE技術分析了12例HBV感染HCC病人腫瘤組織和臨近非腫瘤肝組織的蛋白質表達差異。在得到的2338個匹配點中,有61個點在腫瘤樣品中顯著上調,158個點顯著下調。經MALDI-TOF-TOF分析,在61個上調點
4、中32個點得到鑒定,對應于23種基因表達產物;158個下調點中,有77個點鑒定為50種基因表達產物。根據Swiss-Prot庫的注釋信息對鑒定的蛋白質進行了功能和細胞定位分析。對部分差異表達蛋白質進行了Westernblot驗證,與DIGE結果有較好一致性。應激誘導蛋白/分子伴侶和與細胞增殖相關的蛋白在HCC腫瘤組織中上調,與氨基酸代謝、脂類代謝和生物轉化相關的蛋白質下調表達。發(fā)現熱休克蛋白70和90家族的幾種成員以及HOP蛋白在HCC
5、腫瘤組織中同時高表達,推測它們可能通過相互作用共同在HBV相關的致癌過程中發(fā)揮作用,而在HCV感染HCC中只報道了熱休克蛋白70家族成員的上調。線粒體和過氧化物酶體蛋白在HCC腫瘤組織中下調表達,4種在肝臟中參與甲基化循環(huán)的代謝酶在HCC腫瘤組織中下調表達。首次報道了在HCC腫瘤組織中不同形式的GAPDH和FTCD同時出現相反表達。首次在HCC組織中對HOP和hnRNPC1/C2的表達水平進行了Westernblot驗證,提示HOP和h
6、nRNPC1/C2可作為HCC組織的候選標志物。 肝實質細胞通過組織間隙液(TIF)這個微環(huán)境與周圍細胞和血液等循環(huán)外液之間進行著物質和信息交換。在腫瘤的發(fā)生過程中,腫瘤細胞所處的微環(huán)境也發(fā)揮了十分重要的作用。同時,腫瘤細胞來源的分泌蛋白或由于壞死破碎而釋放的細胞蛋白也會存在于這個微環(huán)境中,成為很好的腫瘤標志物。因此,對TIF進行研究,不僅會對腫瘤的發(fā)生機制提供有益的信息,還將為腫瘤標志物的尋找提供新的思路。我們建立了大鼠肝臟以
7、及正常成人肝臟TIF的提取方法。該方法經過了以線粒體蛋白COXIV和CytoC、細胞質膜蛋白flotillin—l以及胞漿蛋白caspase-3等亞細胞器蛋白進行的污染評價;對成人正常肝臟TIF進行了蛋白質得率的對比實驗,選擇lh作為TIF的孵育時間。對TIF進行2DE展示,表明TIF的蛋白質構成與組織細胞和血漿均有較大的區(qū)別,具有獨特性。對正常成人肝臟TIF進行SDS-PAGE分離加Q-TOF鑒定全譜分析,鑒定了460種蛋白質,其中包
8、含了與細胞通訊、識別、黏附、信號轉導、骨架蛋白裝配及轉運相關的重要蛋白質。對鑒定蛋白質進行分子量、pI值分布分析,結果表明:鑒定蛋白質的pI值為4~12,密集區(qū)為6~7;分子量跨度從7836Da~532072Da,多數蛋白小于100kDa,尤其集中于20~30kDa(21.7%)。為我們以后對其分析時的方法學選擇提供了有益的參考。對鑒定蛋白質進行細胞定位分析,結果表明:TIF中存在較多細胞漿、細胞核和細胞質膜蛋白,它們的存在可能與胞吐、
9、胞吞、分泌、細胞膜囊泡脫落過程以及細胞降解產物的釋放有關。將鑒定蛋白質與HPPP數據進行比較,僅有63種TIF蛋白質能在血漿中找到(占TIF中蛋白質總數的14%),表明與血漿相比,TIF中有更高濃度的組織局部蛋白,包含了更多的信息,提示TIF可能是一種更具潛力的尋求疾病相關蛋白質標志物的分析材料。之后,對l例HCC病人的腫瘤一非腫瘤肝臟TIF進行了差減分析,在lO種高可靠性的差異蛋白中,有6種已報道在HCC中上調表達,證明了分析方法的可
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