蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的改進(jìn)及對(duì)肝細(xì)胞肝癌的研究.pdf

1、目的: 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究包括前期的樣本提取與純化;中期的蛋白質(zhì)分離與分析鑒定;后期的數(shù)據(jù)處理與分析。蛋白質(zhì)鑒定與基因測(cè)序相比，最主要的困難是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及組成遠(yuǎn)比基因復(fù)雜，而且蛋白質(zhì)組是動(dòng)態(tài)變化的，所以蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定技術(shù)高通量的限制因素之一就是蛋白質(zhì)的分離技術(shù)。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略是基于二維電泳-質(zhì)譜技術(shù)(2-DE-MS)，二維電泳分離能力有限，而液相色譜(LC)彌補(bǔ)了雙向凝膠電泳的缺陷，由此我們需要探索新型適用于復(fù)雜生物樣品中蛋

2、白質(zhì)酶解及分離技術(shù)，來(lái)提高蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定水平。腫瘤性疾病從蛋白質(zhì)組學(xué)角度又被認(rèn)為是一種蛋白質(zhì)缺陷病，在其發(fā)生發(fā)展的不同階段，即使在沒(méi)有任何癥狀的早期或癌前病變期，在血清中蛋白質(zhì)水平上往往就已經(jīng)發(fā)生了變化。將新型的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和整合方式，應(yīng)用于臨床腫瘤性疾病的診斷，驗(yàn)證其在復(fù)雜體液蛋白質(zhì)組學(xué)研究中具有一定的可行性。
　　方法: 1、用promega和自主修飾Self-owned胰蛋白酶酶解不同濃度的牛血清白蛋白(bull ser

3、um albumin，BSA)測(cè)定其總離子流圖(TIC)并利用ProteomeDiscoverer軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，測(cè)定BSA的覆蓋率。2、用自主修飾Self-owned胰蛋白酶酶解BSA，將酶切液用本研究制備的二維一體毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行分離，應(yīng)用高效液相色譜與質(zhì)譜(nanoHPLC-MS)技術(shù)平臺(tái)，通過(guò)TIC、保留時(shí)間(retention time，RT)和信號(hào)強(qiáng)度，考察其毛細(xì)管色譜柱分離性能及重復(fù)性。3、選取2012年3月至2013年

4、6月在天津市第三中心醫(yī)院進(jìn)行體檢的30例健康人、和肝膽外科進(jìn)行治療的20例HBV相關(guān)性肝炎患者、20例HBV相關(guān)性肝硬化患者和20例肝細(xì)胞肝癌術(shù)前患者的血清，其中血清為納入標(biāo)準(zhǔn)的患者入院伊始未經(jīng)過(guò)任何治療的早上空腹血清樣本，借助nanoHPLC-MS技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行前期處理與分析鑒定，將處理所得數(shù)據(jù)在利用OMSSA軟件進(jìn)行分析，鑒定蛋白質(zhì)數(shù)量，為后續(xù)篩選潛在蛋白標(biāo)志物做準(zhǔn)備。
　　結(jié)果: 1、用promega和自主修飾Self-o

5、wned胰蛋白酶酶解不同濃度的BSA，即在完全相同的實(shí)驗(yàn)條件下，自主修飾Self-owned胰蛋白酶在nanoHPLC-MS技術(shù)鑒定高、中、低濃度BSA的覆蓋率為38.22％、28.34％、13.18％;而用promega胰蛋白酶酶解BSA的覆蓋率為34.93％、26.36％、10.21％。2、用自主修飾Self-owned胰蛋白酶和本研究制備的二維一體毛細(xì)管色譜柱聯(lián)用，應(yīng)用于BSA的分析，通過(guò)LTQ-Orbitrap XL質(zhì)譜進(jìn)行分析

6、，其在極低濃度條件下，鑒定BSA的覆蓋率為24.22％。3、在完全相同的實(shí)驗(yàn)條件下做兩次，觀察本研究所制備的二維一體毛細(xì)管色譜柱的重復(fù)性，選取BSA酶切的肽段混合物中相應(yīng)強(qiáng)度較高的質(zhì)荷比(m/z)740.4為特征肽段，兩次的RT分別是51.90min、51.95min及信號(hào)強(qiáng)度分別是6.77×105、7.42×105。4、通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)改進(jìn)和整合，利用自主修飾Self-owned胰蛋白酶對(duì)血清中提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，借助nanoH

7、PLC-MS技術(shù)平臺(tái)，采用強(qiáng)陽(yáng)離子交換與反相C18二維一體毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行分離和LTQ Orbitrap XL質(zhì)譜的蛋白準(zhǔn)確定量，再利用OMSSA軟件的強(qiáng)大數(shù)據(jù)處理功能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，最終鑒定出3578種蛋白。
　　結(jié)論: 通過(guò)對(duì)鑒定BSA理化性能的統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明自主修飾Self-owned胰蛋白酶具有高催化活性，我們所制備的二維一體毛細(xì)管色譜柱具有較好的分離性能和重復(fù)性。本研究將這種技術(shù)改進(jìn)和整合方式應(yīng)用于人血清樣本中

8、，經(jīng)過(guò)Self-owned胰蛋白酶酶解、二維一體毛細(xì)管色譜柱分離、LTQ Orbitrap XL質(zhì)譜的蛋白準(zhǔn)確定量，再通過(guò)OMSSA軟件對(duì)前期所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，最終鑒定出3578種蛋白。此鑒定的蛋白數(shù)足以支持其后期的數(shù)據(jù)處理，篩選具有潛在表達(dá)差異的蛋白標(biāo)志物。為后續(xù)尋找肝臟腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有早期診斷、監(jiān)測(cè)價(jià)值的蛋白標(biāo)志物打好基礎(chǔ)。由此可推斷此種方法在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中具有一定的可行性，可以在液-質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)中用于復(fù)雜體液、細(xì)胞或組織等復(fù)