磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)定性與定量分析技術(shù)的研究及在肝細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)的磷酸化修飾在生命活動(dòng)中具有重要的調(diào)控作用，因此也是目前蛋白質(zhì)組中翻譯后修飾研究的熱點(diǎn)，系統(tǒng)地對生物樣本中磷酸化蛋白質(zhì)組的研究有助于闡明磷酸化介導(dǎo)的生理病理機(jī)制。但由于生物體內(nèi)磷酸化蛋白質(zhì)的含量及磷酸化位點(diǎn)的化學(xué)計(jì)量值常常很低，大規(guī)模分析磷酸化蛋白質(zhì)在技術(shù)上還很具有挑戰(zhàn)性。肝臟在機(jī)體生命活動(dòng)中執(zhí)行多種重要生理功能，其中許多功能是通過可逆的磷酸化修飾調(diào)節(jié)的，對肝細(xì)胞模型的磷酸化蛋白質(zhì)組的研究有助于人們更深入地理解和認(rèn)識肝臟的復(fù)雜功能

2、以及蛋白質(zhì)的磷酸化修飾在肝臟功能中的意義。 本研究分別從定性分析與定量分析兩個(gè)層面對肝細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組進(jìn)行了研究。 第一部分以標(biāo)準(zhǔn)磷酸化蛋白及酵母蛋白質(zhì)為樣本，首先優(yōu)化了富集磷酸肽的SCX分離技術(shù)路線，接著采用SCX-Q-TOF/SCX-LCQ互補(bǔ)的分析策略對人Chang肝細(xì)胞中磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行了研究。共鑒定到559個(gè)磷酸化位點(diǎn)、409個(gè)磷酸化肽段和370個(gè)磷酸化蛋白，其中69％(255/370)的磷酸化蛋白和82％(

3、271/327)的磷酸化位點(diǎn)是Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中沒有報(bào)道的。分析發(fā)現(xiàn)其中許多蛋白質(zhì)在生物體中發(fā)揮著與肝臟的生理和病理密切相關(guān)的重要功能。該數(shù)據(jù)集是目前第一個(gè)人正常肝細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組的報(bào)道，為正常肝細(xì)胞與癌細(xì)胞對照分析提供了依據(jù)。 第二部分首先建立了<'18>O標(biāo)記的磷酸化肽段定量分析技術(shù)，并對方法學(xué)進(jìn)行了考察和優(yōu)化。之后建立了IPG-IEF-TiO<,2>聯(lián)合分離富集方法與高準(zhǔn)確度高靈敏度的LTQ-FT液相色譜質(zhì)譜聯(lián)

4、用的磷酸化研究策略，通過比較考察發(fā)現(xiàn)該策略不但能有效地對磷酸化肽段進(jìn)行富集，而且與<'18>O標(biāo)記定量技術(shù)兼容性良好，該工作目前還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。輔助編寫了<'18>O標(biāo)記定量分析配套軟件MSOQ，實(shí)現(xiàn)了<'18>O標(biāo)記定量技術(shù)數(shù)據(jù)處理的自動(dòng)化及規(guī)范化。最后將上述建立的<'18>O-IPG-IEF-TiO<,2>-LTQ-FT技術(shù)路線用于HepG2/HepG2-HBx細(xì)胞模型的定性及定量磷酸化蛋白質(zhì)組研究。共鑒定到1358個(gè)磷酸化位點(diǎn)

5、，958個(gè)磷酸化肽段和895個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)(groups)。85％的磷酸化蛋白和90％以上的磷酸化位點(diǎn)是swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中沒有報(bào)道的。從Chang細(xì)胞和HepCJ2細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)N端磷酸化肽段占很大比例的現(xiàn)象，推斷肝細(xì)胞中磷酸化修飾有可能更容易發(fā)生在蛋白柔韌性好并暴露在外面的N端區(qū)域。穩(wěn)定同位素標(biāo)記定量分析得到三方面的差異定量信息：157個(gè)差異磷酸化位點(diǎn)，182個(gè)差異磷酸化蛋白質(zhì)和1362個(gè)差異非磷酸化蛋白質(zhì)。還發(fā)現(xiàn)有一些磷酸化