磷酸化蛋白質組學定性與定量分析技術的研究及在肝細胞磷酸化蛋白質組學中的應用.pdf

1、蛋白質的磷酸化修飾在生命活動中具有重要的調控作用，因此也是目前蛋白質組中翻譯后修飾研究的熱點，系統(tǒng)地對生物樣本中磷酸化蛋白質組的研究有助于闡明磷酸化介導的生理病理機制。但由于生物體內磷酸化蛋白質的含量及磷酸化位點的化學計量值常常很低，大規(guī)模分析磷酸化蛋白質在技術上還很具有挑戰(zhàn)性。肝臟在機體生命活動中執(zhí)行多種重要生理功能，其中許多功能是通過可逆的磷酸化修飾調節(jié)的，對肝細胞模型的磷酸化蛋白質組的研究有助于人們更深入地理解和認識肝臟的復雜功能

2、以及蛋白質的磷酸化修飾在肝臟功能中的意義。 本研究分別從定性分析與定量分析兩個層面對肝細胞磷酸化蛋白質組進行了研究。 第一部分以標準磷酸化蛋白及酵母蛋白質為樣本，首先優(yōu)化了富集磷酸肽的SCX分離技術路線，接著采用SCX-Q-TOF/SCX-LCQ互補的分析策略對人Chang肝細胞中磷酸化蛋白質進行了研究。共鑒定到559個磷酸化位點、409個磷酸化肽段和370個磷酸化蛋白，其中69％(255/370)的磷酸化蛋白和82％(

3、271/327)的磷酸化位點是Swiss-Prot數據庫中沒有報道的。分析發(fā)現其中許多蛋白質在生物體中發(fā)揮著與肝臟的生理和病理密切相關的重要功能。該數據集是目前第一個人正常肝細胞磷酸化蛋白質組的報道，為正常肝細胞與癌細胞對照分析提供了依據。 第二部分首先建立了<'18>O標記的磷酸化肽段定量分析技術，并對方法學進行了考察和優(yōu)化。之后建立了IPG-IEF-TiO<,2>聯(lián)合分離富集方法與高準確度高靈敏度的LTQ-FT液相色譜質譜聯(lián)

4、用的磷酸化研究策略，通過比較考察發(fā)現該策略不但能有效地對磷酸化肽段進行富集，而且與<'18>O標記定量技術兼容性良好，該工作目前還沒有相關文獻報道。輔助編寫了<'18>O標記定量分析配套軟件MSOQ，實現了<'18>O標記定量技術數據處理的自動化及規(guī)范化。最后將上述建立的<'18>O-IPG-IEF-TiO<,2>-LTQ-FT技術路線用于HepG2/HepG2-HBx細胞模型的定性及定量磷酸化蛋白質組研究。共鑒定到1358個磷酸化位點

5、，958個磷酸化肽段和895個磷酸化蛋白質(groups)。85％的磷酸化蛋白和90％以上的磷酸化位點是swiss-Prot數據庫中沒有報道的。從Chang細胞和HepCJ2細胞中都發(fā)現N端磷酸化肽段占很大比例的現象，推斷肝細胞中磷酸化修飾有可能更容易發(fā)生在蛋白柔韌性好并暴露在外面的N端區(qū)域。穩(wěn)定同位素標記定量分析得到三方面的差異定量信息：157個差異磷酸化位點，182個差異磷酸化蛋白質和1362個差異非磷酸化蛋白質。還發(fā)現有一些磷酸化