大鼠肝再生的亞細(xì)胞—線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、肝臟是人體各種物質(zhì)代謝、能量轉(zhuǎn)換及供應(yīng)的樞紐和主導(dǎo)器官,是機(jī)體內(nèi)多種重要信息調(diào)控分子的“集散地”。與其他器官不同,肝臟具有強(qiáng)大的再生能力。創(chuàng)傷和各種肝病后,殘存肝組織很快會(huì)進(jìn)入復(fù)雜的再生過程。肝再生一直是哺乳動(dòng)物肝臟研究中的一個(gè)重要焦點(diǎn)。研究肝再生分子機(jī)理必將對(duì)肝臟移植、創(chuàng)傷、各種肝病及肝腫瘤診治具有重要意義。因?yàn)楦渭?xì)胞再生的機(jī)制非常復(fù)雜,影響因素眾多,目前盡管對(duì)肝再生進(jìn)行了大量分子生物學(xué)研究,但是對(duì)肝再生的分子機(jī)理,尤其是肝再生啟動(dòng)和

2、終止的機(jī)制仍不清楚。 到目前為止,對(duì)肝再生的研究大多集中在基因水平,蛋白質(zhì)整體水平的研究還相對(duì)較少。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)的誕生為肝再生的研究提供了一個(gè)很好的平臺(tái)。蛋白質(zhì)組學(xué)是以細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的存在及其活動(dòng)方式為研究對(duì)象。由于其研究的是生命活動(dòng)的直接體現(xiàn)者和執(zhí)行者-蛋白質(zhì),因此更接近生理或病理的本質(zhì)。差異蛋白質(zhì)組是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)主要內(nèi)容,其核心在于尋找某種特定因素引起樣本之間蛋白質(zhì)組的差異,揭示并驗(yàn)證蛋白質(zhì)組

3、在生理或病理過程中的變化。亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)(subcellularproteomies)極大的降低了針對(duì)全細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究的復(fù)雜性,已日益成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)焦點(diǎn)。其一方面可以明確各種亞細(xì)胞的蛋白組成,促進(jìn)對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的理解,另一方面可以獲得新蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位信息,促進(jìn)對(duì)其生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)。 線粒體(Mt)是真核細(xì)胞內(nèi)一重要的亞細(xì)胞,除作為能量生產(chǎn)場(chǎng)所外,已發(fā)現(xiàn)其參與了多種細(xì)胞生理病理活動(dòng),大量研究表明線粒體直接參與了

4、肝再生過程。然而線粒體在肝再生中的具體作用并不清楚,肝再生中線粒體蛋白的整體改變也沒有研究。本研究通過建立大鼠肝再生模型,利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法,從亞細(xì)胞-線粒體蛋白質(zhì)整體水平對(duì)肝再生過程進(jìn)行研究,將有利于闡明肝細(xì)胞再生的分子機(jī)理,豐富對(duì)肝損傷和術(shù)后肝再生修復(fù)機(jī)制的認(rèn)識(shí)和了解,為再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。 第一部分 肝再生過程中線粒體差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究 本部分研究中我們建立了經(jīng)典的大鼠肝再生模型,SD大鼠隨機(jī)分為70％肝部分切

5、除組(PH組)和假手術(shù)對(duì)照組(Sham-operated,SH組),每組5只動(dòng)物。PH組大鼠在無菌條件下切除肝左葉和中葉(約為全肝的70％);SH組大鼠同樣開腹,但不切肝。70％PHx 24 h(早期),72 h(中期),168 h(晚期)后,處死大鼠,迅速取右葉肝組織,Nycodenz密度梯度離心分離亞細(xì)胞Mt,提取Mt蛋白,以SH組為對(duì)照,進(jìn)行雙向凝膠電泳分離蛋白,PDQuest7.4軟件對(duì)雙向電泳圖譜進(jìn)行分析,找出與肝再生相關(guān)的差

6、異蛋白。對(duì)肝再生早期的差異蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定,生物信息學(xué)分析。同時(shí),對(duì)部分差異蛋白分別進(jìn)行了mRNA和蛋白水平驗(yàn)證。在肝再生早期,我們共篩選出25個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)(P<0.05),與SH組相比,PH組中上調(diào)的蛋白點(diǎn)有3個(gè)；多數(shù)下調(diào),有22個(gè)。質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF MS)技術(shù)成功鑒定出其中22個(gè)差異蛋白。經(jīng)生物信息學(xué)分析這些差異蛋白參與了多條代謝途徑,如糖代謝,脂代謝,呼吸鏈和氧化磷酸化,生物轉(zhuǎn)化以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。這些結(jié)果表明7

7、0％PHx后,肝細(xì)胞Mt通過多條代謝途徑對(duì)肝再生進(jìn)行調(diào)節(jié),提示Mt很可能在肝再生早期發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)肝再生早期-PH 24h,肝細(xì)胞生長出現(xiàn)一停滯階段,推測(cè)可能與此時(shí)Mt蛋白下調(diào),功能下降相關(guān),提示Mt可能是肝再生過程中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)點(diǎn)。 第二部分 差異蛋白Prohibitin(PHB)的功能探討 Proh-bitin作為線粒體內(nèi)膜的一保守蛋白,報(bào)道其與多種細(xì)胞活動(dòng)相關(guān),如腫瘤抑制、周期調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、增殖、凋

8、亡、衰老等。到目前為止,其許多功能和作用機(jī)制仍然不是很清楚。Prohibitin在各種疾病中的作用研究較多,在肝再生過程中的研究很少。我們發(fā)現(xiàn)肝再生早期Mt內(nèi)的Prohbitin表達(dá)下調(diào),考慮到Prohibitin與多種細(xì)胞活動(dòng)相關(guān),而肝再生是一復(fù)雜過程,多種細(xì)胞活動(dòng)參與其中,推測(cè)其很可能在肝再生過程中發(fā)揮重要作用。因此,我們對(duì)肝再生過程中Prohibitin的表達(dá),亞細(xì)胞分布以及功能進(jìn)行了研究。 本部分研究包括體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)兩

9、部分。通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)：肝再生過程中Prohibitin的mRNA和蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)出相同的變化,均為早期降低,增殖期輕微上升,晚期明顯上升,但蛋白變化不如mRNA變化明顯,說明體內(nèi)Prohibitin存在翻譯后修飾；Prohibitin在大鼠肝細(xì)胞中主要位于Mt內(nèi),核中也有,但我們?cè)诎褐形礄z測(cè)到；肝再生過程中Mt內(nèi)Prohibitin的蛋白表達(dá)早期下降,增殖期升高,晚期恢復(fù)正常水平,結(jié)合實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的降低的Mt量在肝再生過程中

10、逐漸升高以及改變的Mt超微結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)正常,我們推測(cè)Mt內(nèi)的Prohibitin在肝再生過程中具有促進(jìn)Mt的重建與穩(wěn)定的作用；肝再生過程中核內(nèi)的Prohibitin的蛋白表達(dá)呈上升趨勢(shì),尤其在肝再生晚期明顯增多,結(jié)合實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的肝再生過程中PCNA指數(shù)的降低,凋亡蛋白酶活力的增高,同時(shí)結(jié)合國外報(bào)道,我們推測(cè)核中的Prohibitin可能參與肝再生過程中增殖與凋亡的調(diào)節(jié)。在體外,通過培養(yǎng)正常大鼠肝細(xì)胞(BRL-3A),細(xì)胞轉(zhuǎn)染,Proh

11、ibitin RNA干擾和Prohibitin過表達(dá)我們進(jìn)一步探討了Prohibitin的功能,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①Prohibitin具有維持大鼠肝細(xì)胞Mt膜電位穩(wěn)定的作用；②Prohibitin能抑制大鼠肝細(xì)胞細(xì)胞周期的進(jìn)入,阻止細(xì)胞從G1期到S期轉(zhuǎn)換；③ProhIbitin具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)合體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)Prohbitin在肝再生中的作用,可能包含mRNA和蛋白兩個(gè)水平的調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Prohibitin在肝再生過

12、程中發(fā)揮重要的作用。其一,Prohibitin參與肝再生過程中Mt的重建,與Mt的穩(wěn)定和功能相關(guān)。其二,Prohibitin通過抑制細(xì)胞周期的進(jìn)入,來抑制肝再生過程中肝組織的過度增殖,同時(shí)能抑制細(xì)胞凋亡,從而調(diào)節(jié)增殖與凋亡間的平衡。 總之,我們首次通過2-DE和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)肝再生過程中線粒體蛋白質(zhì)組的改變進(jìn)行了研究。應(yīng)用亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究線粒體蛋白的差異表達(dá),不僅有利于闡明肝再生的分子機(jī)制,同時(shí)為研究線粒體在其它疾病中的作