大鼠原代系膜細胞亞細胞組分的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、背景與目的：蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是指在一個細胞的整個生命過程中由基因組表達的以及表達后修飾的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)可以通過對細胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)進行大規(guī)模的研究，真實的反映機體內(nèi)環(huán)境的情況，揭示疾病的發(fā)病機理，為疾病早期診斷提供特異性的標(biāo)志物。細胞亞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組是最近新發(fā)展起來的蛋白質(zhì)組學(xué)，通過研究細胞亞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，可以明確蛋白質(zhì)的具體定位，以及蛋白質(zhì)在不同亞組分中的轉(zhuǎn)運與細胞功能的關(guān)系，對于闡明細胞的功能調(diào)控機制有非常重要的

2、作用。系膜細胞是腎小球的基本組成細胞之一，許多腎小球腎炎如糖尿病腎病、IgA腎病等都能夠引起系膜細胞的異常。本研究通過研究正常系膜細胞亞組分的蛋白質(zhì)組學(xué)，建立系膜細胞亞組分蛋白質(zhì)表達譜，初步分析各組分蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，揭示蛋白質(zhì)調(diào)控系膜細胞功能的作用機制。
　　 方法：(1)大鼠的原代系膜細胞的分離提取和鑒定：利用篩網(wǎng)技術(shù)，首先得到純化的腎小球，經(jīng)Ⅳ型膠原酶消化，獲得原代系膜細胞，培養(yǎng)至8-10代。vimentin、desmi

3、n免疫熒光鑒定系膜細胞。(2)分離提純系膜細胞亞組分蛋白質(zhì)：利用碧云天細胞亞組分抽提試劑盒分離提純系膜細胞漿蛋白、細胞膜蛋白、細胞核蛋白。western blot檢測MDH1、Na-K-ATPase、TBP在各組分中的表達。(3)膠內(nèi)酶解：蛋白質(zhì)經(jīng)10％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，將各亞組分電泳條帶膠塊切割成12段，并用胰蛋白酶酶解。(4)質(zhì)譜鑒定：采用UPLC-QTOF(Waters公司)液相質(zhì)譜進行鑒定，采用protein

4、 Lynx Global Serverversion2.4進行數(shù)據(jù)處理軟件，最后用NCBI大鼠數(shù)據(jù)庫進行檢索。(5)生物信息學(xué)分析：利用BINGO軟件對各亞組分蛋白質(zhì)進行細胞成分分析，采用博奧公司的MAS軟件分析各亞組分的蛋白質(zhì)生物學(xué)功能。(6)細胞骨架定位的驗證：利用免疫熒光和Western blot驗證SEPT2和F-Actin的表達。
　　 結(jié)果：(1)系膜細胞鑒定：免疫熒光結(jié)果顯示，vimentin、desmin在系膜細

5、胞胞漿里表達，證明提取細胞為系膜細胞；(2)細胞亞組分純度驗證，WesternBlot結(jié)果顯示：MDH1在細胞漿內(nèi)表達，Na-K-ATPase在細胞膜和細胞核表達均有，TBP在細胞核與細胞漿內(nèi)均由表達。證明各亞組分取其它組分污染。(3)亞組分蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析：共鑒定出細胞漿蛋白993個，其中新發(fā)現(xiàn)細胞漿蛋白292個；細胞膜蛋白647個，其中新發(fā)現(xiàn)細胞膜蛋白382個；細胞核蛋白740個，其中新發(fā)現(xiàn)細胞核蛋白451個。這些亞組分蛋白質(zhì)

6、協(xié)同參與調(diào)控細胞骨架的調(diào)節(jié)、代謝進程、轉(zhuǎn)錄與翻譯、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運及應(yīng)激等生物功能。(4)細胞骨架蛋白蛋白F-Actin和SEPT2的驗證。Wesetern blot和免疫熒光結(jié)果顯示，F(xiàn)-Actin和SEPT2在細胞漿蛋白、細胞膜蛋白、細胞核蛋白均有表達，與質(zhì)譜檢測數(shù)據(jù)一致。
　　 結(jié)論：本實驗采用了SDS-PAGE/LC-MS技術(shù)，成功的獲取了各亞組分的蛋白質(zhì)表達譜，并發(fā)現(xiàn)了新的亞組分蛋白質(zhì)。這些亞組分蛋白質(zhì)協(xié)同參與了生物