三氯乙烯對人正常肝細(xì)胞亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組影響的研究.pdf

1、目的:
　　觀察三氯乙烯（trichloroethylene，TCE）對人正常肝細(xì)胞（L-02細(xì)胞）亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的影響，探討其潛在肝毒性作用機(jī)制。
　　方法：
　?。?）細(xì)胞增殖水平的測定及膜蛋白富集的驗(yàn)證。采用CCK-8的方法建立TCE致L-02肝細(xì)胞劑量-反應(yīng)關(guān)系，通過SPSS軟件計(jì)算其半數(shù)抑制濃度（IC50）。在IC50確定的基礎(chǔ)上，以IC50值倍減的濃度梯度進(jìn)行TCE染毒，進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，以測定細(xì)胞的增殖活

2、性。利用ProteoExtractTM subcellular proteome extraction kit試劑盒提取膜蛋白組分、核蛋白組分和胞漿蛋白組分。以Na+/K+-ATPase作為膜蛋白的標(biāo)志物，通過Western Blot分析膜蛋白組分和胞漿蛋白組分中Na+/K+-ATPase的表達(dá)水平，總蛋白組分作為對照組進(jìn)行膜蛋白富集的驗(yàn)證。以Lamin B1作為核蛋白的標(biāo)志物，同樣通過Western Blot分析其表達(dá)水平，總蛋白做對

3、照。
　?。?）2D-DIGE(two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis)結(jié)合MALDI-TOF/TOF-MS(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)技術(shù)分析篩選并鑒定差異表達(dá)亞細(xì)胞蛋白。具體方法是2.0 mmol/L和8.0 mmo

4、l/L TCE處理L-02細(xì)胞后提取膜蛋白組分和核蛋白組分，未經(jīng)TCE處理的L-02細(xì)胞所提取的膜蛋白組分作為對照組，共分成4批細(xì)胞提取。提取的膜蛋白組分經(jīng)過準(zhǔn)確定量后，進(jìn)行熒光標(biāo)記和雙向電泳。獲得的圖像經(jīng)過掃描后使用 DeCyder software package進(jìn)行分析，尋找到差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)后進(jìn)行普通雙向考染，接著對考染的膠進(jìn)行挖膠酶解，最后獲得的樣品進(jìn)行MALDI-TOF/TOF-MS鑒定分析，核蛋白組分也按照上述方法進(jìn)行處理

5、分析。
　?。?）生物信息學(xué)分析。通過在線分析軟件TMpred program對鑒定出來的膜蛋白組成差異蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domain）的預(yù)測。STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建L-02細(xì)胞經(jīng)過TCE處理與未經(jīng)過TCE處理差異表達(dá)的膜蛋白及核蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)。利用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進(jìn)行生物過程富集分析。
　?。?）TCE染毒 L-02細(xì)胞后差異表達(dá)亞細(xì)胞蛋白的驗(yàn)證。分別以0 mmol/L、2.0

6、mmol/L、4.0 mmol/L、8.0 mmol/L劑量的TCE染毒L-02肝細(xì)胞，24 h后，用Western Blot去檢測差異表達(dá)膜蛋白和核蛋白，驗(yàn)證前期亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)篩選鑒定結(jié)果的可靠性。
　　結(jié)果：
　　（1）TCE染毒L-02細(xì)胞24 h后的半數(shù)抑制濃度為16.0 mmol/L。采用1/2的IC50為最大染毒劑量，發(fā)現(xiàn)2.0 mmol/L，4.0 mmol/L，8.0 mmol/L TCE染毒組與對照組（0

7、 mmol/L）相比均具有顯著性差異，TCE對細(xì)胞的增殖活性產(chǎn)生影響顯著。Na+/K+-ATPase在膜蛋白組分中的表達(dá)水平顯著高于在全蛋白組分和胞漿蛋白組分（全蛋白質(zhì)、胞漿蛋白和膜蛋白質(zhì)的相對濃度分別為1.0±0.10、0.12±0.01和1.5±0.16，P<0.01）。Lamin B1在核蛋白組分的表達(dá)水平顯著高于全蛋白和胞漿蛋白組分（全蛋白質(zhì)、胞漿蛋白和核蛋白質(zhì)的相對濃度分別為1.0±0.05、0.08±0.01和2.3±0.2

8、8，P<0.01）。這些結(jié)果表明膜蛋白質(zhì)和核蛋白質(zhì)均在各自組分得到良好的富集，可用于后續(xù)分析。
　?。?）利用2D-DIGE結(jié)合MALDI-TOF/TOF-MS的方法共鑒定出15個(gè)差異蛋白。通過TMpred數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)在膜蛋白組分的15個(gè)差異蛋白中，有10個(gè)具有1個(gè)以上的跨膜結(jié)構(gòu)域，說明這10個(gè)蛋白為膜蛋白。另外4個(gè)蛋白沒有跨膜區(qū)，但它們的亞細(xì)胞定位與細(xì)胞膜相關(guān)。而在核蛋白組分的24個(gè)差異蛋白中，有22蛋白的亞細(xì)胞定位與細(xì)胞核

9、相關(guān)。DAVID富集分析表明差異表達(dá)蛋白主要與 RNA過程相關(guān)，尤其在RNA剪接這一生物學(xué)過程出現(xiàn)明顯的聚集。通過STRING分析，膜蛋白功能富集較松散，核蛋白功能富集較緊密。
　　（3）不同濃度TCE處理前后膜蛋白ATP合成酶β亞基（ATP5B）、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（P4HB）、核蛋白核不均一性核糖核蛋白H2（HNRNPH2）和上游識別序列結(jié)合蛋白（FUBP1）的表達(dá)水平。所有驗(yàn)證的蛋白變化趨勢與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致（P<0.05或

10、P<0.01）。
　　結(jié)論：
　?。?）本研究應(yīng)用一種提取亞細(xì)胞器的方法，該方法能有效地富集 L-02細(xì)胞的膜蛋白和核蛋白組分，2D-DIGE結(jié)合 MALDI-TOF/TOF-MS技術(shù)可實(shí)現(xiàn)差異亞細(xì)胞蛋白的鑒定分析，為外源性化合物致細(xì)胞的亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了新思路和新方法。
　?。?） TCE染毒可以引起L-02肝細(xì)胞中膜蛋白質(zhì)組表達(dá)水平的改變，這些差異蛋白在細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)及細(xì)胞穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)聚集，相互作用