抗生素敏感實(shí)驗(yàn)

1、第三十四章抗微生物藥物和敏感性試驗(yàn)陳文昭,,第一節(jié) 臨床常用抗菌藥物,抗菌藥物（antibacterial agents）:具有殺菌或抑菌活性的抗生素和化學(xué)合成藥物。抗生素：細(xì)菌、真菌、放線菌等的代謝產(chǎn)物化學(xué)合成藥物：經(jīng)化學(xué)改造的半合成抗生素和化學(xué)合成藥物,,抗菌藥物： 對(duì)病原微生物具有較高的 “選擇性毒性作用” 對(duì)患者不造成損害,抗菌藥物的作用機(jī)制,a.干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成

2、b.損傷細(xì)菌細(xì)胞膜c.影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成d.抑制細(xì)菌核酸的合成e.抑制細(xì)菌葉酸的代謝f.抑制結(jié)核環(huán)脂酸的合成,一、青霉素類抗生素,天然青霉素：青霉素G 青霉素V 不產(chǎn)青霉素酶的G+球菌和G-球菌 耐青霉素酶青霉素：苯唑西林 氯唑西林 奈夫西林 氟氯西林 產(chǎn)青霉素酶的G+菌和G-球菌,氨基組青霉素：氨芐西林

3、 阿莫西林等 青霉素G敏感的細(xì)菌，大部分大腸、奇變、流感等G-菌。 羧基組青霉素：替卡西林 羧芐西林等 氨芐西林無效的G-菌，產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的腸桿菌和假單胞菌有作用脲基組青霉素：美洛西林 阿洛西林 派拉西林等 75％克雷伯菌、銅綠假單胞菌有抑制作用，腸桿菌、厭氧菌有好作用、對(duì)腸球菌和鏈球菌強(qiáng)于羧基組,廣譜青霉素：,作用機(jī)制,青霉素類抗生素作用于細(xì)胞壁合成后階

4、段的酶 阻斷肽聚糖合成的最后階段—肽聚糖鏈的組裝和三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。 該階段由下面幾種酶催化完成： 轉(zhuǎn)糖基酶、轉(zhuǎn)肽酶、D-羧肽酶、內(nèi)肽酶 不同β-內(nèi)酰胺類抗生素在不同程度上有抑制上述酶的作用,二、頭孢菌素類抗生素,第一代頭孢菌素：頭孢噻吩、頭孢唑啉等 對(duì)G+菌有較強(qiáng)作用 第二代頭孢菌素：頭孢呋辛、頭孢克洛等

5、 對(duì)產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的G-桿菌有作用第三代頭孢菌素：頭孢噻肟、頭孢他啶等 對(duì)產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的G-桿菌有較強(qiáng)的作用第四代頭孢菌素：頭孢吡肟、頭孢匹羅等 對(duì)腸桿菌科細(xì)菌和銅綠假單孢菌作用強(qiáng),作用機(jī)制,頭孢菌素類抗生素和青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合,抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成。PBP位于質(zhì)膜，不同的頭孢菌素與不同的PBP結(jié)合，發(fā)生不同的效應(yīng)，使菌形成絲狀體或球體，最終溶解死亡。,三、其他β-內(nèi)酰胺類抗生素,單環(huán)-內(nèi)酰胺

6、類抗生素：氨曲南 對(duì)G-桿菌作用強(qiáng)頭霉素類：頭孢西丁、頭孢替坦、頭孢美唑 對(duì)G+菌和產(chǎn)ESBLS有較好作用氧頭孢烯類：拉氧頭孢-氧頭孢烯類衍生物 對(duì)產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的G-桿菌有較強(qiáng)的作用，對(duì)產(chǎn)酶的金葡菌也有一定作用碳青霉烯類抗生素：亞胺培南、美洛培南等 對(duì)G-桿菌（除嗜麥芽窄食單胞菌外）有很強(qiáng)的活性,三、其他β-內(nèi)酰胺類抗生素,β-內(nèi)酰胺酶抑制

7、劑- 與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用能增強(qiáng)后者的抗菌活性克拉維酸 可從鏈霉菌培養(yǎng)液中分離得到舒巴坦 半合成的酶抑制劑他唑巴坦 半合成的酶抑制劑青霉素+ β -內(nèi)酰胺酶抑制劑,四、氨基糖苷類抗生素,鏈霉素 、卡那霉素 、妥布霉素 、核糖霉素 、巴龍霉素 、新霉素 慶大霉素 、福提霉素阿米卡星、奈替米星、 地貝卡星革蘭陰性桿菌有強(qiáng)大的抗菌活性 ；革蘭陰性球菌效果差；革蘭陽性球菌有一定活性大觀霉素、丙大觀

8、霉素：淋病奈瑟菌敏感，解脲脲原體敏感,作用機(jī)制,氨基糖苷類抗生素和細(xì)菌核糖體30S小亞基發(fā)生不可逆的結(jié)合，抑制MRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白合成；造成遺傳密碼子的錯(cuò)讀，產(chǎn)生無意義的蛋白質(zhì)；吸附在菌體表面，造成細(xì)胞膜的損傷，導(dǎo)致膜的滲漏，胞內(nèi)的K+、腺嘌呤等物質(zhì)外漏。,喹諾酮類抗生素,第一代喹諾酮類抗生素：奈啶酸等 大腸桿菌有作用第二代喹諾酮類抗生素：環(huán)丙沙星、氧氟沙 星、諾氟沙星等 對(duì)G+菌和G-菌均有

9、作用第三代喹諾酮類抗生素（超廣譜類抗生素）：左氧氟沙星、司帕沙星等 對(duì)G+菌（如MRS、PRSP、腸球菌）作用強(qiáng)于二代4-8倍,作用機(jī)制,作用于DNA旋轉(zhuǎn)酶,干擾細(xì)菌DNA的修復(fù)和重組,六、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,常用的有：紅霉素、麥迪霉素等 主要用于G+菌，對(duì)苛養(yǎng)菌及厭養(yǎng)菌有作用，對(duì)衣原體、支原體、立克次體、螺旋體等有抑制作用新一代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素：阿齊霉素、羅紅霉素、克拉霉素、地紅霉素等

10、 較紅霉素有更強(qiáng)的抗菌活性,作用機(jī)制,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可逆結(jié)合在細(xì)菌核糖體50S大亞基的23S單位上,抑制肽酰基轉(zhuǎn)移酶,影響核蛋白位移,抑制細(xì)菌蛋白合成和肽鏈的延伸。,七、四環(huán)素、氯霉素和林可酰胺類抗生素,四環(huán)素類抗生素 廣譜抗生素 米諾環(huán)素 多西環(huán)素等 四環(huán)素類抗生素主要與細(xì)菌30S核糖體亞單位結(jié)合，阻滯

11、氨?；D(zhuǎn)移RNA與信使RNA核蛋白體的受位位點(diǎn)的結(jié)合，阻滯肽鏈延伸，抑制蛋白質(zhì)合成。,七、四環(huán)素、氯霉素和林可酰胺類抗生素,氯霉素類抗生素 易進(jìn)入腦組織 氯霉素 甲砜霉素 氯霉素主要作用于細(xì)菌70S核糖體的50S亞基，使肽鏈延長(zhǎng)受阻而抑制蛋白質(zhì)合成。,七、四環(huán)素、氯霉素和林可酰胺類抗生素,林可酰胺類抗生素 鹽酸林可霉素

12、 克林霉素 G+球菌、白喉?xiàng)U菌、 破傷風(fēng) 梭菌、厭氧菌、沙眼衣原體 林可酰胺類抗生素與細(xì)菌50S核糖體亞基結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)合成，并可干擾肽酰基的轉(zhuǎn)移，阻止肽鏈的 延長(zhǎng)。,八、糖肽類抗生素,萬古霉素 替考拉寧 對(duì) G+球菌有強(qiáng)大的活性多粘菌素B和E G-菌強(qiáng)大的活性 糖肽類抗生素與一個(gè)或多個(gè)肽聚糖合成

13、中間產(chǎn)物D-丙氨酰-D-丙氨酸末端形成復(fù)合物，可阻斷肽聚糖合成中的轉(zhuǎn)糖基酶、轉(zhuǎn)肽基酶及D-D羧肽酶的作用。,磺胺類藥物及增效劑,用于全身感染，口服吸收好：磺胺甲惡唑、磺胺嘧啶、磺胺甲氧吡嗪；用于腸道，口服吸收差：柳氮磺胺啶銀、磺胺二甲氧嘧啶；局部應(yīng)用：磺胺米隆、磺胺醋酰鈉,作用機(jī)制,磺胺類藥物分子結(jié)構(gòu)中含有對(duì)氨基笨磺酰胺，能竟?fàn)幮缘嘏c二氫葉酸合成酶結(jié)合，阻止氨基苯甲酸與二氫葉酸合成酶結(jié)合，使菌體內(nèi)核酸合成重要物質(zhì)輔酶F（四氫葉酸）鈍

14、化而導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制。 甲氧芐胺嘧啶（TMP）能與二氫葉酸還原酶結(jié)合，抑制二氫葉酸還原酶，使二氫葉酸還原成四氫葉酸受阻而達(dá)到抑菌目的。,其他合成抗菌藥,硝基呋喃類：用于腸道、尿路感染和外用 呋喃坦啶、呋喃唑酮 干擾細(xì)菌體內(nèi)的氧化還原酶系統(tǒng)，阻斷細(xì)菌的代謝，產(chǎn)生抑殺細(xì)菌的作用,其他合成抗菌藥,硝基咪唑類：甲硝唑、替硝唑

15、 用于厭氧菌 硝基咪唑類藥物被厭氧菌還原而阻斷DNA合成，從而阻止DNA的轉(zhuǎn)錄復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。 替硝唑可干擾DNA合成，并能穿透細(xì)胞膜，快速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。,第二節(jié) 抗菌藥物敏感性試驗(yàn),抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的意義試驗(yàn)常規(guī)抗菌藥物選擇抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的方法 肉湯稀釋法 瓊脂稀釋法 紙片瓊脂擴(kuò)散法 E

16、試驗(yàn),抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的意義,預(yù)測(cè)療效指導(dǎo)醫(yī)生合理選擇抗生素耐藥監(jiān)測(cè)，分析耐藥變遷，掌握耐藥菌感染的流行情況，控制預(yù)防耐藥菌感染的發(fā)生和流行,試驗(yàn)常規(guī)抗菌藥物選擇,根據(jù)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)：A組：常規(guī)首選藥物B組：臨床使用主要抗生素C組：對(duì)A組藥物耐藥的流行菌株，對(duì)A組過敏的病人和不常見的細(xì)菌U組：僅用于尿道中分離的細(xì)菌,方法：肉湯稀釋法,常量稀釋法和微常量稀釋法培養(yǎng)基：M-H肉湯（苛養(yǎng)菌加添加劑）藥物稀釋

17、 藥物原液制備 稀釋抗菌藥物 菌種接種 （對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，5X105 CFU/ML） 結(jié)果判斷,方法：瓊脂稀釋法,培養(yǎng)基：M-H瓊脂（苛養(yǎng)菌加添加劑）含藥瓊脂制備菌種接種（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 0.5麥?zhǔn)蠁挝唬┙Y(jié)果判斷,方法：紙片瓊脂擴(kuò)散法,試驗(yàn)原理：將含有抗菌藥物的紙片貼于已接種測(cè)試菌的瓊脂平板上，紙片中藥物吸收瓊脂中水分后向紙片周圍擴(kuò)散

18、形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)，測(cè)試菌的生長(zhǎng)被抑制，形成無菌生長(zhǎng)的透明圈即為抑菌圈。,紙片瓊脂擴(kuò)散法,培養(yǎng)基：M-H瓊脂抗菌藥物紙片菌種接種結(jié)果判斷和報(bào)告,方法： E試驗(yàn),原理：結(jié)合稀釋法和擴(kuò)散法原理對(duì)微生物藥 物敏感性試驗(yàn)直接定量的技術(shù)E試條：無孔載體上固定有一系列預(yù)先制備的，濃度呈連續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)稀釋抗生素，另一面有讀數(shù)和判別的刻度。細(xì)菌接種和加樣結(jié)果判斷和報(bào)告,,

19、,,,,,,,,,,E,F,B,C,A,D,,,,,,,,MIC,,E test法,,,,,,MIC,ETST,藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果解釋,敏感：測(cè)試菌可被測(cè)定藥物常規(guī)劑量給藥后，在機(jī)體內(nèi)達(dá)到的血藥濃度所抑制或殺滅。耐藥：測(cè)試菌不能被在體內(nèi)感染部位可能達(dá)到的抗菌藥物濃度所抑制。中介：提示該細(xì)菌對(duì)常規(guī)用藥后，體液或組織中的藥物濃度的反應(yīng)低于敏感株，但在一些部位（如尿液中的喹諾酮類）或使用高于正常給藥量（如β-內(nèi)酰胺類）臨床上使用有療效。,

20、聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)和殺菌試驗(yàn),聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)的意義 治療混合感染 預(yù)防和推遲抗生素耐藥性的發(fā)生 可減少劑量以避免達(dá)到中毒劑量 比單一用藥時(shí)效果更好,聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)和殺菌試驗(yàn),抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用可出現(xiàn)4種結(jié)果：無關(guān)作用拮抗作用累加作用協(xié)同作用最低殺菌濃度測(cè)定,監(jiān)控抗生素的治療效果試驗(yàn),血清抗菌藥物濃度測(cè)定1、微生物測(cè)定法2、熒光偏振免疫測(cè)定3、高壓液相層析法4、均相酶免疫測(cè)定法血清抗菌

21、活性測(cè)定,自動(dòng)化儀器檢測(cè),自動(dòng)化儀器Microscan 、Vitek都有測(cè)定MIC功能和檢測(cè)ESBL的專用孔和專家系統(tǒng)。,第三節(jié)細(xì)菌的耐藥性和產(chǎn)生機(jī)制,專題講座,第四節(jié)細(xì)菌的耐藥性檢查方法,,特殊耐藥菌檢測(cè),對(duì)MRSA/MRSE檢測(cè)青霉素耐藥的肺炎鏈球菌（PRSP）檢測(cè)對(duì)萬古霉素耐藥的腸球菌(VRE)檢測(cè)ESBLS檢測(cè) Ampc檢測(cè),一、MRSA/MRSE檢測(cè),1、正確鑒定葡萄球菌2、MRSA/MRSE的鑒定

22、 高滲培養(yǎng)基（2~4%Nacl） 較低的孵育溫度（33~35攝氏度） 時(shí)間：MRSA 24h MRSE 48h,檢測(cè)MRSA/MRSE的方法,甲氧西林或苯唑西林篩選RSA/MRSE標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法微量肉湯稀釋法,甲氧西林或苯唑西林篩選MRSA/MRSE,MH瓊脂+4% Nacl+苯唑西林 6μg或甲氧西林10μg用0.5McFarland菌液接種35℃

23、 孵育24h肉眼可見的菌落生長(zhǎng)即為MRS,標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法,在M.H瓊脂(2% Nacl)上用0.5McFarland的 菌液劃線接種。貼上甲氧西林或苯唑西林紙片（1μg），35℃孵育24h。苯唑西林抑菌圈小于或等于10mm。 甲氧西林抑菌圈小于或等于9 mm。,微量肉湯稀釋法,M.H肉湯+2%Nacl+苯唑西林或甲氧西林。用0.5Mcfarland菌液接種，35℃孵育24hMIC：苯唑西林≥4μg/ml

24、 甲氧西林≥16μg/ ml,二、對(duì)青霉素耐藥的肺炎鏈球菌（PRP）的檢測(cè),篩選：苯唑西林紙片預(yù)測(cè)肺炎鏈球菌對(duì)青霉素的敏感性方法:用含1μg苯唑西林紙片,標(biāo)準(zhǔn)K—B法作藥敏試驗(yàn),,結(jié)果：抑菌環(huán)≥20 mm敏感 MIC ≤19 mm作肉湯或瓊脂稀釋試驗(yàn)測(cè)MIC 藥物的選擇：青霉素、四環(huán)素、紅霉素、TMP/SMZ、頭孢菌素和萬古霉素。,,肺炎鏈球菌對(duì)青霉素的敏感株(MIC:0.03-0.06μg/ml)對(duì)氨芐西林

25、﹑阿莫西林﹑阿莫西林/克拉維酸﹑第二﹑三代頭孢菌素和泰能敏感.,,肺炎鏈球菌對(duì)青霉素的MIC值≥1.0μg/ml的肺炎鏈球菌稱為耐青霉素的肺炎鏈球菌(PRP)MIC值在0.12-1.0μg/ ml之間的菌株為相對(duì)耐藥(低耐)菌株(PIP)MIC≤0.6μg/ ml為敏感株,三、對(duì)萬古霉素耐藥的腸球菌,耐藥性可分為低水平耐藥(MIC8-32mg/L)高水平耐藥(MIC≥64mg/L)根據(jù)腸球菌對(duì)萬古霉素和替考拉寧的不同耐藥水平及耐

26、藥基因，VRE分為四個(gè)表型，分別是VanA﹑ VanB ﹑VanC ﹑VanD,VRE:的分型及其耐藥表型,類型 萬古霉素（μg/ ml） 替考拉寧VanA R（64-1000） R（16-512）VanB R（4-1024） S（0.25-2）VanC I （2-32） S (0.12-2)VanD （16-64） S（2-4）,,V

27、RE的檢測(cè)方法： 稀釋法，紙片擴(kuò)散法 Etest 和自動(dòng)化儀器VanA﹑B﹑C（Etest和瓊脂篩選法最好，敏感率為100%）,稀釋法VRE篩選試驗(yàn) （瓊脂稀釋法）,1、BHI瓊脂+6ug/ ml萬古霉素2、用0.5 Mcfarland菌液接種，35 ℃ 24h 3、 >1個(gè)菌落 R 肉湯：生長(zhǎng) R,,VRE篩選陽性必須做

28、MIC確認(rèn)，并觀察動(dòng)力和色素，以區(qū)分獲得性耐藥（VanA 、VanB）,及某些菌種存在的固有的中介（8-16μg/ ml）耐藥（VanC）,兩者在感染控制中意義不同。,四、ESBLS檢測(cè),（一）初篩試驗(yàn) 1.儀器 MIC≥2μg/ ml2.紙片擴(kuò)散法 頭孢泊肟或頭孢他啶≤22 mm 頭孢曲松≤25 mm

29、 頭孢噻肟或氨曲南≤27mm,四、ESBLS檢測(cè),（二）確證實(shí)驗(yàn) 頭孢他啶（CAZ） 頭孢他啶+克拉維酸（CAZ/CLV） 頭孢噻肟（CTX） 頭孢噻肟+克拉維酸（CTX/CLV） 差值≥5mm 確定為ESBLs,五、Ampc 檢測(cè),三維實(shí)驗(yàn) 制粗提酶： 將50ul0.5麥?zhǔn)蠁挝淮郎y(cè)菌液加入12ml肉湯中 35℃搖床上震搖4-6h，離心

30、4000轉(zhuǎn)/min 集菌 -80℃反復(fù)凍溶5次， 4℃ 10000轉(zhuǎn)/min 離心收集上清液-20℃保存。,,2.檢測(cè)AMP C酶 在MH平板上均勻涂抹0.5麥?zhǔn)蠁?位ATCC25922 中心貼頭孢西叮紙片 在距紙片5mm處切槽 將粗提酶液加入槽內(nèi) 35℃孵育24h 如果在抑菌圈內(nèi)有細(xì)菌生長(zhǎng)，則AMP C 陽性。,,第五節(jié) 抗分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn),抗分枝桿菌藥物一線藥：

31、 異煙肼、 利福平、 吡嗪酰胺、 乙胺丁醇、 鏈霉素二線藥： 氨基水楊酸、 乙硫異煙胺、 環(huán)絲氨酸、 卷曲霉素、 卡那霉素 、 利福噴丁,結(jié)核分枝桿菌和緩慢生長(zhǎng)分枝桿菌體外抑菌試驗(yàn),結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)指針結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)方法 培養(yǎng)基 Middlebrook7H10瓊脂+油酸、白蛋白、葡聚糖等 藥敏試驗(yàn)藥物 細(xì)菌接種,快速生長(zhǎng)分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn),1、稀釋法：

32、 操作方法基本同需氧和兼性厭氧法MH肉湯或CAMHB加入0.02％Tween 80和玻珠，接種菌液，30℃孵育3-5天。,快速生長(zhǎng)分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn),2、瓊脂紙片洗脫法 先將含藥紙片放入6孔組織培養(yǎng)板中，以洗脫液洗脫，再加入溶化冷卻的HA4.5ML，使之凝固成含藥平板。 0.5麥?zhǔn)蠁挝痪?1：100稀釋 每孔10微升 30℃孵育