根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)ACS反義基因轉(zhuǎn)化文心蘭的研究.pdf

1、文心蘭(Oncidium spp.)為蘭科文心蘭屬植物，是熱帶氣生蘭，因其花形獨(dú)特、花姿優(yōu)美、花色亮麗，而倍受人們的喜愛(ài)，市場(chǎng)需求量正迅速增長(zhǎng)。本研究以“小櫻桃”文心蘭試管苗的葉片和根切段為材料誘導(dǎo)原球莖，建立文心蘭高效再生系統(tǒng)和受體系統(tǒng)，并采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)文心蘭原球莖進(jìn)行ACS反義基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究。主要研究結(jié)果如下： 1.文心蘭高效再生系統(tǒng)的建立。以文心蘭試管苗的葉片和根切段為材料，研究了文心蘭再生系統(tǒng)建立的有效途徑。

2、試驗(yàn)結(jié)果表明，文心蘭葉片在1/2 MS+6-BA0.2 mg/L+NAA1.0mg/L的培養(yǎng)基上，原球莖誘導(dǎo)率達(dá)72.6％，優(yōu)于根切段在此培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率，因此葉片適宜作為文心蘭原球莖的誘導(dǎo)材料；以MS為基本培養(yǎng)基時(shí)，BA、NAA濃度分別為2.5mg/L、0.5 mg/L或2.0 mg/L、0.5 mg/L時(shí)，原球莖增殖系數(shù)高；原球莖分化的最適培養(yǎng)基選擇1/2 MS+6-BA0.8 mg/L+NAA0.2 mg/L；最佳的壯苗生根培養(yǎng)基

3、為1/2 MS+NAA0.5mg/L+蘋(píng)果汁100 g/L；在文心蘭煉苗移栽時(shí)宜選擇水草作為移栽基質(zhì)。 2.文心蘭受體系統(tǒng)的建立及其優(yōu)化。在文心蘭遺傳轉(zhuǎn)化研究中，若采用較大顆粒的原球莖為受體易產(chǎn)生嵌合體，不利于后期的鑒定篩選，這就要求對(duì)原球莖的生長(zhǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得適宜遺傳轉(zhuǎn)化的細(xì)小、顆粒狀明顯的原球莖受體材料。因此，試驗(yàn)以文心蘭試管苗的葉片誘導(dǎo)出的原球莖為材料，比較不同激素配比、基本培養(yǎng)基、pH值、糖類(lèi)型和糖濃度、光照條件、

4、抗生素對(duì)文心蘭原球莖生長(zhǎng)的影響，并對(duì)各因素進(jìn)行優(yōu)化，篩選最佳的受體材料生長(zhǎng)條件，以建立適于遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，最適宜建立文心蘭原球莖受體系統(tǒng)的培養(yǎng)基是1/2 MS+6-BA2.5 mg/L+NAA0.5 mg/L，其最佳培養(yǎng)條件為30.0 g/L白糖為最佳糖源和糖濃度、pH為5.4、瓊脂濃度為5.8 g/L、15001x光照強(qiáng)度及20～25℃的培養(yǎng)溫度。文心蘭原球莖對(duì)卡那霉素敏感，25.0 mg/L卡那霉素能夠有效地抑制原

5、球莖的生長(zhǎng)并使其致死，而50.0 mg/L卡那霉素能夠有效地抑制未轉(zhuǎn)化植株的生根，因此，25.0 mg/L卡那霉素和50.0 mg/L卡那霉素分別為文心蘭進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)原球莖受體系統(tǒng)和小苗生根培養(yǎng)的有效選擇壓濃度。 3.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)ACS反義基因?qū)胛男奶m轉(zhuǎn)化體系的確立。試驗(yàn)結(jié)果表明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化試驗(yàn)條件為選擇固體培養(yǎng)30 d的原球莖，侵染前經(jīng)過(guò)切割去頂端后培養(yǎng)于附加0.25mol/L甘露醇的高滲固體培養(yǎng)基進(jìn)行前處理5h，農(nóng)桿菌菌

6、液濃度OD600為0.4，農(nóng)桿菌重懸液白糖濃度為30.0 g/L，農(nóng)桿菌的侵染時(shí)間為35 min，在25℃黑暗條件下于附加2.5mg/L6-BA和0.5 mg/L NAA的1/2 MS培養(yǎng)基中共培養(yǎng)4d，共培養(yǎng)培養(yǎng)基pH值為5.4。將上述優(yōu)化條件進(jìn)行了30瓶約1200個(gè)文心蘭原球莖的遺傳轉(zhuǎn)化，GUS瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)，在最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件下，文心蘭原球莖的GUS瞬時(shí)表達(dá)率為66.25％。 4.文心蘭抗性原球莖、抗性植株的篩選及轉(zhuǎn)基因植株移栽

7、。對(duì)轉(zhuǎn)化ACS反義基因的原球莖進(jìn)行抗性篩選及轉(zhuǎn)基因植株再生研究，采用延遲篩選法先對(duì)侵染過(guò)的原球莖在1/2MS+6-BA2.5 mg/L+NAA0.5 mg/L+ Cef50.0 mg/L培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)生長(zhǎng)30d，再逐步提高卡那霉素濃度后，置于1/2 MS+6-BA2.5 mg/L+NAA0.5 mg/L十Cef50.0 mg/L+Km25.0mg/L培養(yǎng)基下篩選3個(gè)月，選擇后的原球莖置于1/2 MS+6-BA0.8 mg/L+NAA0

8、.2 mg/L分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)，將分化的小苗轉(zhuǎn)移到1/2 MS+NAA0.5 mg/L+蘋(píng)果汁100 g/L+Cef50.0 mg/L+Km50.0 mg/L篩選壯苗生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。初步觀察轉(zhuǎn)基因植株在生物學(xué)性狀上與未轉(zhuǎn)基因植株無(wú)顯著差異，轉(zhuǎn)基因植株移栽2個(gè)月后成活。 5.文心蘭抗性植株的檢測(cè)。對(duì)文心蘭抗性再生植株的葉片進(jìn)行GUS穩(wěn)定表達(dá)檢測(cè)和ACS反義基因、gus基因的PCR檢測(cè)。試驗(yàn)共獲得了121株由抗性原

9、球莖分化出的小苗，其中23株在卡那霉素抗性篩選中生根，生根的抗性植株經(jīng)GUS組織化學(xué)檢測(cè)和ACS、gus基因的PCR檢測(cè)有9株擴(kuò)增到目的條帶，初步證明ACS反義基因和gus基因已整合進(jìn)文心蘭基因組中。 總之，本研究建立了文心蘭高效再生系統(tǒng)；獲得了淡黃色、顆粒狀明顯的原球莖受體材料，建立了適宜遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)；首次將ACS反義基因轉(zhuǎn)入文心蘭并建立了穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系；摸索出了文心蘭抗性原球莖的篩選方法和篩選時(shí)期；發(fā)現(xiàn)在不使用AS