根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Expansin基因轉(zhuǎn)化煙草的研究.pdf

1、Expansin是近年來發(fā)現(xiàn)的迄今惟一能誘導(dǎo)熱鈍化的離體細(xì)胞壁伸展的細(xì)胞壁特異性蛋白質(zhì)。Expansin在控制植物細(xì)胞生長方面，能調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的膨脹?？梢酝ㄟ^生長素調(diào)控，引起pH下降，激活相關(guān)水解酶，引起木葡聚糖或β-葡聚糖等半纖維素的降解，打斷半纖維素與纖維素微纖絲之間的氫鍵，改變細(xì)胞壁的承重網(wǎng)絡(luò)，從而加速生長。如果將Expansin基因轉(zhuǎn)入楊樹、桉樹等重要林木，則可以提高林木的生長速率，加速成材，具有很大的應(yīng)用前景及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。煙草是最

2、早也是最多應(yīng)用于分子生物學(xué)和基因工程研究的模式植物之一。本實(shí)驗(yàn)通過農(nóng)桿菌菌介導(dǎo)法用含有抗卡那霉素的nptⅡ基因的雙元載體將Expansin基因?qū)氲綗煵萑~外植體中，然后在含有卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，并經(jīng)過PCR檢測，獲得了一批煙草轉(zhuǎn)基因植株。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.高效植株再生體系的建立 (1)芽的誘導(dǎo) 經(jīng)比較確定14-18d苗齡煙草的葉片為再生能力較強(qiáng)的外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，從設(shè)計(jì)的一系列培養(yǎng)基

3、中按效果篩選出MS+6-BA0.5mg/L為誘導(dǎo)芽分化的培養(yǎng)基，出芽多，葉外植體平均出芽數(shù)為8.7個(gè)；生長快，7d左右即可誘導(dǎo)出芽來。 (2)芽的生根 以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，從設(shè)計(jì)的一系列培養(yǎng)基中按效果篩選出1/2MS+IAA0.1mg/L為芽的生根培養(yǎng)，生根率達(dá)100％，根系發(fā)達(dá)，呈輻射狀。 本實(shí)驗(yàn)基本上建立了高效煙草植株再生體系，為更多外源目的基因的導(dǎo)入奠定了基礎(chǔ)。 2.煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建

4、立 (1)卡那霉素篩選濃度的確定 由于所構(gòu)建的植物表達(dá)載體攜帶有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptⅡ)基因，因此以Kan為篩選試劑選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。煙草葉片外植體在Kan25mg/L的培養(yǎng)基上能正常分化出芽，可保持綠色，與在0mg/L的培養(yǎng)基上無明顯差異；在Kan濃度為50mg/L的篩選條件下，葉片的分化受到抑制；Kan濃度為75mg/L時(shí)，葉片絕大多數(shù)白化；Kan濃度為100mg/L時(shí)，芽的分化率為0，葉片基本上白化，停止生長，不分

5、化。故選用kan濃度100mg/L作為試驗(yàn)中增殖、分化培養(yǎng)的篩選濃度。 (2)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草基因轉(zhuǎn)化及影響轉(zhuǎn)化的各因素分析在利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化的過程中，設(shè)置了菌液稀釋倍數(shù)、浸染時(shí)間、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間4個(gè)因素，研究分析這些因素對遺傳轉(zhuǎn)化效果的影響。結(jié)果顯示，采用預(yù)培養(yǎng)3d的葉外植體，將處于生長對數(shù)期的農(nóng)桿菌菌液稀釋30倍(于先天晚上接種于30mL的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)18h)，浸染3-5min，

6、共培養(yǎng)3d后移入加有羧芐青霉素500mg/L和卡那霉素100mg/L的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)8d左右，可得2-3cm的抗性芽，然后將抗性芽移入生根培養(yǎng)基，15d左右可得抗性苗。 本實(shí)驗(yàn)對根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了較為系統(tǒng)的比較研究，旨在建立一種轉(zhuǎn)化效率高、穩(wěn)定性好、通用性較強(qiáng)的煙草農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)體系。 3.轉(zhuǎn)基因PCR檢測 對煙草轉(zhuǎn)化植株的檢測主要采用PCR方法。以抗性植株的總DNA為模板，以質(zhì)粒DNA為陽性對照，以未轉(zhuǎn)