根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)BG2基因遺傳轉(zhuǎn)化花生的研究.pdf

1、花生是重要的油料兼經(jīng)濟(jì)作物，真菌病害是花生的主要病害，導(dǎo)致其產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降。單純依靠常規(guī)育種方法很難選育出對(duì)真菌病害高抗的品種。而利用遺傳轉(zhuǎn)化將外源基因?qū)牖ㄉ耘喾N則應(yīng)具有一定的可行性。本研究首先對(duì)花生組織培養(yǎng)植株再生方法進(jìn)行研究，建立了胚小葉高效再生體系，然后利用遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將β-1，3-葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)入花生品種花育22，以提高花生抗病性。主要研究結(jié)果如下： 1.利用8個(gè)花生品種對(duì)花生組織培養(yǎng)進(jìn)行研究

2、，結(jié)果表明：(1)基因型對(duì)再生率有很大影響，不同花生品種的愈傷組織形成和不定芽發(fā)生有明顯的差異。(2)花生外植體對(duì)花生組織培養(yǎng)的植株再生具有很大影響，胚小葉的芽誘導(dǎo)率明顯高于子葉、胚軸、胚根等其它外植體。(3)胚小葉的葉齡對(duì)不定芽誘導(dǎo)有很大影響，萌發(fā)5、6天的種子的胚小葉有利于誘導(dǎo)不定芽的形成，其中萌發(fā)6d的胚小葉最高，芽誘導(dǎo)率為91.3％。(4)以花生胚小葉作為外植體用于組織培養(yǎng)離體再生，具有取材簡(jiǎn)單，來(lái)源豐富，再生率高的優(yōu)點(diǎn)，可將其

3、用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化。 (5)不同培養(yǎng)基對(duì)不定芽的伸長(zhǎng)有很大影響，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加4mg/LBAP的培養(yǎng)基，芽伸長(zhǎng)比較明顯，添加10mg/LBAP的培養(yǎng)基中芽叢生明顯。 2.確定了km的選擇壓，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加km最低濃度為50mg/L可有效抑制非轉(zhuǎn)化愈傷組織的形成或芽再生。添加500mg/LCb可有效抑制農(nóng)桿菌LBA4404的生長(zhǎng)，且對(duì)花生外植體的再生無(wú)顯著影響。 3.對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的適宜條件進(jìn)行研究

4、，結(jié)果表明：(1)預(yù)培養(yǎng)3天的花生胚小葉外植體最適宜進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化。(2)菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率影響較大，以O(shè)D600=0.4為最好。(3)適宜侵染時(shí)間為10-15min，轉(zhuǎn)化率較高。(4)農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時(shí)間3d，轉(zhuǎn)化率較高。(5)種子萌發(fā)后6d的胚小葉為受體轉(zhuǎn)化效果最好。 4.將β-1，3-葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)入花生栽培品種。利用優(yōu)化的遺傳轉(zhuǎn)化體系，以萌發(fā)6d的花生品種花育22的胚小葉為外植體，經(jīng)農(nóng)桿菌LBA4404侵染，Km篩選和標(biāo)記基因P

5、CR檢測(cè)，得到目的基因轉(zhuǎn)化植株。 5.確立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)途徑進(jìn)行花生遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)規(guī)程：選用花生品種白沙1016或花育22的成熟飽滿的種子。經(jīng)表面消毒后，接種于催芽培養(yǎng)基上，取萌發(fā)6d的胚小葉，接種于MSB5+6.0mg/LBAP+1.0mg/LNAA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)3d。用活化的農(nóng)桿菌重懸浮菌液(OD600=0.4)浸染10-15min，共培養(yǎng)3d，經(jīng)700mg/LCb浸泡沖洗后，轉(zhuǎn)接到MSB5+6.0mg/LBAP+1.0mg/