根癌農(nóng)桿菌介導LEAFY基因轉(zhuǎn)化蘋果的研究.pdf

1、蘋果是世界上主要的果樹樹種之一，但其進入結(jié)果期較晚，影響了早期經(jīng)濟效益的獲得，而通過生物技術將促進開花的基因?qū)胩O果基因組內(nèi)，促進其提早開花結(jié)果是一條十分重要的途徑，將獲得‘一勞永逸’的效果。本試驗以M26蘋果砧木組培苗為試材，對影響蘋果砧木莖段再生和根癌農(nóng)桿菌介導蘋果遺傳轉(zhuǎn)化的因素進行了系統(tǒng)研究，初步建立了M26蘋果砧木莖段的再生體系，優(yōu)化了根癌農(nóng)桿菌介導M26蘋果砧木的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并以在擬南芥克隆的花分生組織特異性基因Leafy(

2、LFY)基因為目的基因，利用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化嘎拉、富士、M26，并通過GUS報告基因檢測到外源GUS基因在再生抗性芽中的表達及聚合酶鏈式反應(PCR)檢測技術初步證明獲得了整合該基因的嘎拉蘋果、富士蘋果、M26新種質(zhì)，為遺傳轉(zhuǎn)化提供了分子生物學證據(jù)。本試驗主要研究如下： 1.通過分析激素、暗培養(yǎng)、莖段部位、放置方式、繼代時間等因素對M26莖段再生的影響，確立了M26莖段高效再生體系：選取繼代培養(yǎng)20～25d的幼嫩莖段的上、中部莖

3、段，以MS為基本培養(yǎng)基附加激素BA4.0mg/L，NAA0.1mg/L，以莖段形態(tài)學下端插入培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)10d后光照培養(yǎng)60d，再生率和出芽數(shù)分別達到73﹪和4.15。 2.不同抗生素對再生枝條生根有一定的抑制作用，卡那霉素5mg/L抑制其生根，而頭孢霉素500mg/L對生根抑制作用不大，Km濃度為5mg/L，Cef500mg/L是枝條生根的最佳抗生素濃度。 3.在M26蘋果轉(zhuǎn)化體系中，頭孢霉素濃度為500m/L時適于

4、作為M26蘋果砧木遺傳轉(zhuǎn)化的抑菌抗生素濃度。以OD600為0.5的菌液侵染外植體3～5min較為適宜。共培養(yǎng)時培養(yǎng)基中添加20mg/L的乙酰丁香酮和3d的共培養(yǎng)有助于提高M26轉(zhuǎn)化外植體的GUS陽性率，同時也保證了較高外植體再生率。共培養(yǎng)后延遲2～3d進行篩選有利于提高根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化的再生率和外植體的GUS的陽性率。本試驗優(yōu)化的根癌農(nóng)桿菌介導蘋果遺傳轉(zhuǎn)化再生體系為：以含BA4.0mg/L，NAA0.2mg/L的MS為培養(yǎng)基，以M26葉

5、片為外植體材料，經(jīng)根癌農(nóng)桿菌侵染3～5min，黑暗共培養(yǎng)3d，共培養(yǎng)培養(yǎng)基中含20mg/L的AS，用頭孢霉素脫菌培養(yǎng)3d，再進行卡那霉素30mg/L選擇壓篩選，經(jīng)過7～8次的繼代篩選，獲得抗性芽、抗性苗，并進行擴繁、生根。 4.不同的遺傳轉(zhuǎn)化體系其轉(zhuǎn)化效率有很大的不同。與葉片再生體系相比，以莖段為外植體進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化莖段經(jīng)GUS組織化學染色檢測，其GUS的瞬時表達率為13.33﹪，表達強度較弱，僅在切口和基部有少量表達；且獲得抗