根癌農(nóng)桿菌介導的ACS反義基因和PEAS基因轉(zhuǎn)化香蕉研究.pdf

1、本研究以香蕉(Musaspp.)品種“天寶蕉”(Musaspp.,AAA類群)為試驗材料，采用根癌農(nóng)桿菌介導法對香蕉遺傳轉(zhuǎn)化體系進行了較為全面的研究。優(yōu)化了香蕉橫切薄片轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；并以該系統(tǒng)進行了ACS反義基因轉(zhuǎn)化香蕉的研究，篩選抗性香蕉芽并再生植株；對轉(zhuǎn)ACS反義基因的薄片進行GUS瞬時表達檢測、再生植株葉片的GUS穩(wěn)定表達檢測及gus基因的PCR檢測；并在實驗室原有基礎上進行PEAS基因轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化、再生植株葉片hpt基因的PCR檢

2、測、移栽等工作。主要研究結果如下： 1.優(yōu)化香蕉橫切薄片培養(yǎng)系統(tǒng)。通過調(diào)整香蕉橫切薄片直接出芽過程中外植體來源、激素種類及濃度、AgNO3等影響因素，優(yōu)化香蕉轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)。選取香蕉低代試管苗的球莖頂端分生組織直接接于不附加其他生長調(diào)節(jié)劑的MS基本培養(yǎng)基上，可獲得較高的出芽率；附加2mg·L-1AgNO3的芽誘導培養(yǎng)基可促進香蕉芽的分化；于MS+1.0mg·L-1BA+0.1mg·L-1NAA+80mg·L-1Ad培養(yǎng)基繼代20

3、d的香蕉低代試管苗的球莖頂端分生組織的橫切薄片適宜作為香蕉遺傳轉(zhuǎn)化的直接受體；香蕉薄片對卡那霉素較為敏感，確定100mg·L-1為篩選工作濃度。 2.以根癌農(nóng)桿菌介導將ACS反義基因?qū)胂憬叮D(zhuǎn)化條件進行了優(yōu)化研究。優(yōu)化后的條件為：不經(jīng)預培養(yǎng)的香蕉莖尖橫切薄片，侵染前用附加0.1mg·L-1甘露醇的高滲固體培養(yǎng)基前處理4h，農(nóng)桿菌重懸液濃度為OD6001.0左右，重懸液中含100g·L-1的蔗糖，接菌時間為10～15min，

4、于26℃黑暗條件下共培養(yǎng)4d，共培養(yǎng)培養(yǎng)基pH值為5.8。以此條件進行了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化試驗。 3.建立香蕉抗性芽篩選、再生植株與轉(zhuǎn)基因檢測的技術體系，對轉(zhuǎn)化ACS反義基因薄片進行抗性芽篩選及轉(zhuǎn)基因植株再生研究，對薄片進行GUS瞬時表達檢測、再生植株葉片的GUS穩(wěn)定表達檢測和gus基因的PCR檢測。采用附加100mg·L-1卡那霉素、2mg·L-1AgNO3的篩選培養(yǎng)基對共培養(yǎng)后的香蕉橫切薄片進行篩選，共獲得5個轉(zhuǎn)ACS反義基因的抗性芽

5、系，其中AgNO3可以抑制殘留農(nóng)桿菌的生長、促進抗性芽的分化。并以這些抗性芽為試驗材料進行再生植株的研究，共獲得了再生植株30株。經(jīng)PCR檢測，gus基因已整合進香蕉基因組，其中來自穩(wěn)定表達GUS的抗性芽，經(jīng)GUS組織化學檢測為轉(zhuǎn)基因植株，其余來自不表達GUS的抗性芽，經(jīng)檢測為不表達GUS的植株。 4.PEAS基因?qū)胂憬堆芯康暮罄m(xù)工作。在實驗室原有的PEAS基因轉(zhuǎn)化香蕉初步研究的基礎上進行優(yōu)化，并對轉(zhuǎn)基因再生植株進行分子檢測、