農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)β-甘露糖苷酶正義、反義基因的棉花.pdf

1、棉纖維是紡織工業(yè)的重要原料，在國民經(jīng)濟中占有重要地位。因此，從分子水平闡明棉纖維發(fā)育的機理，具有重要的理論價值和現(xiàn)實意義。 為了研究β-甘露糖苷酶(GhManA2)在棉纖維發(fā)育中的確切功能，．本研究將其基因序列以正向，反向構(gòu)建到由纖維特異啟動子E6驅(qū)動的植物表達載體pBll21中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入棉花，試圖通過該基因在纖維發(fā)育中的過量表達和抑制表達對棉纖維發(fā)育的影響來研究其在纖維發(fā)育中的確切功能。本研究包括以下2個方面：

2、 利用DNA重組技術(shù)將基因GhManA2序列以正向，反向構(gòu)建到由纖維特異啟動子E6驅(qū)動的植物表達載體pBI121-E6中，經(jīng)過SmaI，NotI酶切鑒定和特異引物的PCR擴增及測序證明載體構(gòu)建成功，可用于棉花的遺傳轉(zhuǎn)化。分別以泗棉3號和W0品系為基因轉(zhuǎn)化受體，將正義、反義GhManA2載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花，共得到53個愈傷系的500株轉(zhuǎn)化的再生植株。 用NPTⅡ和啟動子．目的基因引物對再生植株DNA進行PCR擴增

3、，初步得到T<,0>代轉(zhuǎn)化的陽性植株230株。正義載體的再生植株中，NPTⅡ基因引物陽性率為97.92％，啟動子．目的基因引物的陽性率為87.23％，反義載體的再生植株中，NPTⅡ基因引物陽性率為95.19％，啟動子-目的基因引物的陽性率為64.65％。只有用NPTⅡ基因引物和啟動子-目的基因引物擴增結(jié)果都為陽性的植株才被初步認(rèn)為是陽性植株。本實驗中，一共嫁接了230株陽性植株，成活了196株。隨機取T<,0>代8株P(guān)CR 陽性再生植株

4、做Southern雜交。結(jié)果證明NPTⅡ基因已經(jīng)整合到植物基因組中。進一步以E6屆動子為探針進行Southern雜交，有部分植株有特異的雜交信號說明T-DNA區(qū)的E6啟動子已整合到棉花基因組中。對T<,1>、T<,2>代轉(zhuǎn)基因植株提取葉片DNA，用啟動子-基因特異引物對其進行PCR 擴增，在檢測的7個T<,1>轉(zhuǎn)基因株系中，目的基因的分離比例都符合孟德爾一對基因的分離比例(3：1)，結(jié)合Southern雜交結(jié)果，推測多拷貝插入的目的基因