根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的rolB基因轉(zhuǎn)化煙草的研究.pdf

1、本研究首先以煙草的帶芽莖段為外植體進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)分化、生長及生根成苗試驗(yàn)。在組織培養(yǎng)的各個(gè)階段的培養(yǎng)基中,附加不同種類及不同質(zhì)量濃度的激素組合,觀察測量外植體在各種培養(yǎng)基中的生長情況,從中篩選出最優(yōu)的激素配比培養(yǎng)基,從而建立了煙草的高效植株再生體系。在此基礎(chǔ)上,將不同質(zhì)量濃度梯度的卡那霉素加入葉片的愈傷組織及不定芽分化階段的培養(yǎng)基中,觀測卡那霉素對外植體生長的影響,以確定各階段的最低致死質(zhì)量濃度,用于煙草的遺傳轉(zhuǎn)化研究。然后對根癌農(nóng)桿

2、菌介導(dǎo)的rolB基因煙草的遺傳轉(zhuǎn)化的條件進(jìn)行了深入探索,在對影響根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的多種因素比較研究后,發(fā)現(xiàn)選擇合適的預(yù)培養(yǎng)天數(shù)、菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)天數(shù)和抗生素的濃度均直接影響根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的效率。通過優(yōu)化這些轉(zhuǎn)化條件,建立了煙草遺傳轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。最后在此基礎(chǔ)上,對轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行PCR檢測,驗(yàn)證rolB基因的插入情況。
　　 1.煙草組培再生體系的建立:
　　 消毒的最佳方法為先用75％酒精浸泡1min,再用0.1

3、％氯化汞浸泡7min。最佳誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基為MS+6BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L。生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+NAA1.0mg/L。移栽煉苗以土壤:蛭石:珍珠巖=2:1:1作為最佳基質(zhì)。
　　 2.煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立試驗(yàn)結(jié)果表明:煙草葉片預(yù)培養(yǎng)3d,將處于生長對數(shù)期的農(nóng)桿菌菌液稀釋30倍,侵染5min后,共培養(yǎng)3d,然后在含500mg/L羧芐青霉素、80mg/L卡那霉素的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選,長出抗性

4、芽后再進(jìn)行生根篩選,可獲得高轉(zhuǎn)化效率。
　　 本實(shí)驗(yàn)對根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究,是為了建立轉(zhuǎn)化效率高、穩(wěn)定性好的煙草農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)體系。
　　 3.轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測對煙草轉(zhuǎn)化植株的檢測主要采用PCR方法。以抗性植株的總DNA為模板,以未轉(zhuǎn)化的植株為陰性對照,以質(zhì)粒DNA為陽性對照,利用外源基因的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
　　 結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增的條帶和質(zhì)粒中的目的條帶一致,而未轉(zhuǎn)化植株沒有