蝴蝶蘭ACS反義基因的遺傳轉(zhuǎn)化及ACS基因的克隆研究.pdf

1、本研究以蝴蝶蘭(Phalaenopsis amabilis)種子幼胚無菌體系為試驗材料，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對蝴蝶蘭ACS反義基因的遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行了較為全面的研究，并以授粉過的蝴蝶蘭唇瓣為材料進(jìn)行了ACS基因的克隆研究，主要的研究結(jié)果如下： 1.蝴蝶蘭再生系統(tǒng)的優(yōu)化。通過不同激素配比、天然附加物的篩選建立了以淡黃色、細(xì)小原球莖為受體系統(tǒng)，并通過對比不同激素濃度、吸附劑、接種處理方式、光照強(qiáng)度及繼代時間、培養(yǎng)方式等影響因素，優(yōu)化蝴蝶

2、蘭轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)。結(jié)果表明：在暗室條件下于KC+6-BA6.0mg/L+NAA0.2mg/L+AC0.5mg/L+Pj100g/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)50d可誘導(dǎo)出蝴蝶蘭細(xì)小原球莖，并適合其增殖；在光照培養(yǎng)條件下于KC+6-BA3.0 mg/L+NAA0.5mg/L+AC1.0 mg/L+Pj150g/利于原球莖的分化出芽，于KC+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+AC1.0mg/L+Pj150g/L培養(yǎng)基上有利于芽苗生根壯苗；去掉

3、頂端的細(xì)小原球莖適宜作為蝴蝶蘭遺傳轉(zhuǎn)化的直接受體；蝴蝶蘭原球莖對卡那霉素不大敏感，500 mg/L才能使原球莖致死，但150mg/L就能限制其生根，因此，150mg/L卡那霉素可作為生根培養(yǎng)時的選擇壓進(jìn)行抗性篩選。 2.以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ACS反義基因?qū)牒m，并對轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化研究。試驗結(jié)果表明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化試驗條件為不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的蝴蝶蘭原球莖，侵染前采用去掉頂端或針刺的處理方式，并在附加0.2mg/L甘露醇的高滲固體培養(yǎng)基前

4、處理4h，農(nóng)桿菌重懸液濃度為OD<,600>0.3左右，接菌時間為20 min，在25℃黑暗條件下于KC+6-BA6.0mg/L+NAA0.2mg/L培養(yǎng)基中共培養(yǎng)4 d，共培養(yǎng)培養(yǎng)基pH值為5.4。 3.建立了蝴蝶蘭抗性原球莖篩選的技術(shù)體系，獲得了再生植株，并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測。對轉(zhuǎn)化ACS反義基因的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行抗性篩選及轉(zhuǎn)基因植株再生研究，對原球莖再生植株葉片進(jìn)行Gus穩(wěn)定表達(dá)檢測。采用延遲篩選法先對侵染過的原球莖在KC+6-BA

5、6.0mg/L+NAA0.2mg/L+AC0.5mg/L+Pj100mg/L+200mg/LCef儲養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)生長一個月，再置于KC+6-BA6.0 mg/L+NAA0.2mg/L+AC0.5mg/L+Pj150g/L+Km500mg/L+Cef=200mg/L培養(yǎng)基下篩選一個月，選擇后的原球莖置于附加200mg/LCef的KC+3.0mg/L6-BA+NAA0.5mg/L+AC 0.5mg/L+Pj150g/L分化培養(yǎng)基上進(jìn)行出芽

6、培養(yǎng)，將分化的植株轉(zhuǎn)移到加有150mg/L卡那霉素和200mg/LCef的KC+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+AClmg/L+Pj150g/L生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，共獲得了7株具卡那霉素抗性的小植株，經(jīng)GUs組織化學(xué)檢測，gus基因已整合進(jìn)蝴蝶蘭。 4.蝴蝶蘭唇瓣ACS基因保守序列的克隆研究。利用改良Trizol法建立了蝴蝶蘭花瓣(唇瓣)總RNA提取和純化方法，解決了蝴蝶蘭花瓣中組織器官內(nèi)多糖、多酚類物質(zhì)的干