根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)凝集素基因轉(zhuǎn)化柑橘遺傳體系的研究.pdf

1、本試驗(yàn)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，以模式植物煙草(Nicotiana benthamiana)和蕓香科植物甜橙(Citrus sinensis)、夏橙(Citrus Natsudaidai Hayata)為材料，成功建立了凝集素基因的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，取得的主要試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1枳殼凝集素基因克隆及分析，采用TA克隆法獲得了枳殼凝集素基因完整ORF序列，其全長為801bp，編碼一個267個氨基酸的開放閱讀框。將該基因插入原核表達(dá)載

2、體pET-28a(+)，獲得重組載體pET-28a(+)-PTA-NH15，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，在1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下高效表達(dá)，SDS-PAGE分析結(jié)果表明，pET-28a(+)-PTA-NH15基因在大腸桿菌中成功地進(jìn)行了表達(dá)，大小為29 kDa。
　　 2枳殼凝集素基因植物表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)植物表達(dá)載體pCAMBIA1301S上的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，利用帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增得到編碼完整開放閱讀

3、框的枳殼凝集素基因，電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)雙酶切驗(yàn)證，該基因已成功構(gòu)建到了植物表達(dá)載體pCAMBIA1301S上。
　　 3枳殼及外源半夏凝集素基因遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系建立通過試驗(yàn)條件的優(yōu)化，最終分別建立了煙草(Nicotiana benthamiana)和柑橘(Citrus)的凝集素基因遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系：試驗(yàn)結(jié)果表明，煙草葉盤在農(nóng)桿菌侵染液中侵染10min，MS(附加100mMol/LAS)共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2d，

4、MS選擇培養(yǎng)基(附加400mg/L頭孢霉素Cef+卡那霉素Kan50mg/L)中進(jìn)行選擇培養(yǎng)時，抗性芽再生率較高，為92.5%，抗性芽在1/2MS+200mg/Lcef+0.3mg/L NAA生根培養(yǎng)基中成功誘導(dǎo)生根；柑橘莖段在農(nóng)桿菌侵染液中侵染30min，MT共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3d，MT選擇培養(yǎng)基(附加Kan50mg/L)上進(jìn)行選擇培養(yǎng)時，抗性芽再生率較高為88.2%，且抗性芽在1/2MT(附加活性炭0.05 g/L)培養(yǎng)基上生根率較高